NY_T 2174-2012主要热带作物品种AFLP分子鉴定技术规程.pdf

ICS 07.080B 04NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2174—2012主要热带作物品种AFLP分子鉴定技术规程Technical code for identifying main tropical crops varieties withAFLP molecular markers2012-06-06 发布2012-09-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 2174—2012前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部农垦局提出。本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所、中国热带农业科学院热带生物技术研究所、中国热带农业科学院南亚热带作物研究所、中国热带农业科学院橡胶研究所。本标准主要起草人：邹冬梅、蒋昌顺、吴坤鑫、雷新涛、曾霞。I NY/T2174—2012主要热带作物品种AFLP分子鉴定技术规程1范围本标准规定了主要热带作物品种AFLP分子鉴定的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、鉴定步骤、结果计算和鉴定规则。本标准适用于橡胶（HeavabrasiliensisMuell-Arg）、芒果（MangiferaindicaLinn.）、荔枝（Litchichinensis Sonn.）、龙眼（Dimocarpus longanaLour.）、香蕉（Musa nanaLour.）、木薯（ManihotesculentaCrants）、柱花草（StylosanthesSW.）的品种AFLP分子鉴定；也可作为其他热带作物品种AFLP分子鉴定参考。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1遗传相似性genetic similarity供检品种与真实品种间在DNA分子遗传上的一致性程度，用遗传相似系数表示。4原理根据不同热带作物品种基因组DNA存在差异，基因组DNA经限制性内切酶双酶切后分别连上特定的接头，再进行预扩增和选择性扩增；由于选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可以被扩增；扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来鉴定品种间的差异。5试剂与材料除非另有说明外，在分析中仅使用确认为分析纯试剂。水为GB/T6682规定的无菌双蒸水或纯度与之相当的水。5.1样品DNA提取试剂5.1.1三羟甲基氨基甲烷(Tris，NHzC(CH2OH)3,CAS:77-86-1)。5.1.2氯化氢（HCI,CAS:7647-01-0）。5.1.3乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2·2H2O,CH14N2Na2O：·2H2O,CAS:6381-92-6)。5.1.4氢氧化钠(NaOH,CAS:1310-73-2)。5.1.5氯仿(CHCI,CAS:67-66-3)。5.1.6异戊醇(C,H12O,CAS:123-51-3)。5. 1.7十六烷基三甲基溴化铵（CTAB,Cl6H33（CH）3NBr，CAS57-09-0）。5. 1.8氯化钠(NaC1,CAS:7647-14-5)。1 NY/T 2174—20125.1.9β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol,C,HsOS,CAS:60-24-2)。5. 1. 10苯酚(CH.O,CAS:108-95-2)。5. 1. 11异丙醇(CsH.O,CAS:67-63-0)。5. 1. 12醋酸钠(CH:COONa,CAS:127-09-3)。5. 1. 13乙酸(C,H,O2,CAS:64-19-7)。5. 1. 1441mol/LTris-HCl(pH8.0):在80mL无菌双蒸水中溶解12.11gTris(5.1.1)加人4.2mL浓HCl5.1.2)调节pH至8.0(溶液冷至室温后，最后调定pH），用无菌双蒸水定容至100mLmol/LEDTA(pH8.0)：在80mL无菌双蒸水中加18.61g乙二胺四乙酸二钠(5.1.3)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠（5.1.4)调节溶液的pH至8.0（约需2g氢氧化钠）然后用无菌双蒸水定容至100mL。5.1.16氯仿：异戊醇（24：1)：先加960mL氯仿（5.1.5)，再加40mL异戊醇（5.1.6)，混合均匀，保存在棕色玻璃瓶中，4℃保存。5.1.17CTAB提取缓冲液：称取4gCTAB(5.1.7)和16.364g NaCl(5.1.8),量取1mol/LTris-HCl(5.1.14)