用于基因克隆的载体ppt课件.ppt

基因工程课程内容;第二章 分子克隆单元操作;基因工程基本流程;2.1 用于基因克隆的载体;一、载体的基本概念;2、载体应具备的条件;3、载体类型;3、载体类型;早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌-牛乳头瘤病毒 迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。 ;;3、载体类型;二、质粒(plasmid);（一）质粒的生物学特性;1、质粒的自主复制性; DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单 位称为复制子（replicon）。一个复制子只含一个复制起点。 细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制 的，而真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复 制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。 ;质粒的复制调控：调控区紧邻ori，方便构建 调控区编码RNAI（反义）和Rop蛋白，抑制复制引物RNAII与模板结合;调控区编码抑制蛋白Cop，控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合;根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：;2、质粒的不相容性;质粒的不相容性的分子机制;3、质粒的可转移性;;4、携带特殊的遗传标记;天然质粒的改造;选择性标记：供重组子筛选用的遗传标记基因 ;质粒载体的特点：;（二）质粒载体的类型;（三）重要的大肠杆菌质粒载体;pBR322质粒载体的优点： 1、具有较小的分子量； 它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 pBR322 DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr 基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点， 3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。 ;;; pBR322质粒载体的改良 为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。; PUC质粒：人们在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 ;2、pUC18 / 19：最优秀的常规克隆载体 ; 一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：  1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）； 2、氨苄青霉素抗性基因（ampr ）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。 3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因； 4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。;pUC18 / 19：正选择标记 lacZ’ 的显色原理（α互补）;pUC质粒载体的优点 第一， 具有较小的分子量和更高的拷贝数; 仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。 第二，适用于组织化学检测重组体； 具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α- 互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定。 第三，具有多克隆位点MCS区段． 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。;3、T载体：克隆PCR产物用;;MCS;T-vector两条链的3’端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A ;4、pGEM：;第一次课所授重点内容的回顾;第二章 分子克隆单元操作;2.1 用于基因克隆的载体;一、载体的基本概念;二、质粒(plasmid);选择性标记：供转化子/重组子筛选用的遗传标记基因 ; 重要的大肠杆菌质粒载体;2、pUC18 / 19：最优秀的常规克隆载体 ;本次课内容 ;（四）质粒DNA的制备与鉴定;氯化铯密度梯度离心法： 对质粒的构象要求较高时采用;碱裂解法： 最常用;构型：;沸水浴法： ;影响质粒DNA产量的因素;（五）质粒载体的不稳定性问题;二、影响质粒载体稳定性的主要因素 新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应 拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响 寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应;二、噬菌体或病毒DNA;噬菌体基本知识;一般溶原性噬菌体的噬菌斑中央残存着已溶原化的细胞，故成为混浊噬菌斑。相反，烈性噬