DB1302T 397-2014 动物产品中动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法.docx
B40
DB1302
唐 山 市 地 方 标 准
DB1302/T397—2014
动物产品中动物源性成分检测方法实时荧光PCR法
2014-11-25发布 2014-12-25实施
唐山市质量技术监督局发布
DB1302/T397—2014
DB1302/T397—2014
前 言
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由唐山市质量技术监督局提出。
本标准由唐山市农牧局归口。
本标准起草单位：唐山市畜牧水产品质量监测中心。
本标准起草人：张建民、张鑫、李爱军、蒙君丽、张雅会、庞学良、周鑫、肖琎、张鹤鹏、赵福国。
DB1302/T397—2014
DB1302/T397—2014
PAGE
PAGE1
动物产品中动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法
范围
本标准规定了动物产品中动物（猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉）源性成分检测实时荧光PCR法。
本标准适用于动物产品中动物（猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉）源性成分定性检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法
术语和定义、缩略语
下列术语和定义、缩略语适用于本文件。
术语和定义
Ct值
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
TaqMan探针
寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，淬灭剂连接在探针的3’末端。
猪源性成分
猪种属特异性DNA片段。
牛源性成分
牛种属特异性DNA片段。
羊源性成分
羊种属特异性DNA片段。
兔源性成分
兔种属特异性DNA片段。
马源性成分
马种属特异性DNA片段。
驴源性成分
驴种属特异性DNA片段。
鸡源性成分
鸡种属特异性DNA片段。
鸭源性成分
鸭种属特异性DNA片段。
鹅源性成分
鹅种属特异性DNA片段。
狗源性成分
狗种属特异性DNA片段。
猫源性成分
猫种属特异性DNA片段。
鼠源性成分
鼠种属特异性DNA片段。
貉源性成分
貉种属特异性DNA片段。
缩略语
DNA：脱氧核糖核甘酸PCR：聚合酶链式反应
原理
利用TaqMan探针实时荧光PCR技术，根据不同物种的特异性基因序列对不同动物源性成分进行鉴定。利用裂解液裂解细胞释放DNA，再结合DNA制备膜技术提取DNA。以提取的DNA为模板，通过特异性引物和荧光物质探针进行动物源性成分实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对动物产品中动物源性成分的定性分析。
材料与试剂
设备和材料
实时荧光PCR检测系统
高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上）
剪刀、镊子（经180℃±2℃，2h高温灭菌）
微量可调移液器及配套吸头（10μL、200μL、1000μL）
实时荧光PCR反应管
离心管（1.5mL、2.0mL）
紫外灯
水浴锅
恒温干燥箱
超纯水机
分析天平：感量为0.00001g
试剂
除特别说明以外试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
无水乙醇（C2H6O）：优级纯
基因组DNA提取试剂盒
本试剂盒分试剂PartⅠ和PartⅡ两部分。详见表1，表2。
表1 PartⅠ组成
注：-20℃保存
注：-20℃保存
1mL
0.5mL
蛋白酶K（ProteinaseK，20mg/mL）
核糖核酸酶A（RNaseA，10mg/mL）
注：缓冲液GL若出现沉淀，于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。缓冲液WB在首次使用前，添加56mL的无水乙醇，混合均匀。试剂盒室温（15℃-25℃）保存。12mL12mL28mL
注：缓冲液GL若出现沉淀，于65℃加热溶解，待恢复至室温后使用。缓冲液WB在首次使用前，添加56mL的无水乙醇，混合均匀。试剂盒室温（15℃-25℃）保存。
12mL
12mL
28mL
24mL
14mL
50支
50支
缓冲液GL（BufferGL）
缓冲液GB（BufferGB）缓冲液WA（BufferWA）缓冲液WB（BufferWB）
洗脱缓冲液（ElutionBuffer）离心柱（SpinColumns）
收集管（ColletionTubes）
动物源性成分试剂盒
猪、牛、羊、兔、马、驴、鸡、鸭、鹅、狗、猫、鼠、貉源性成分实时荧光PCR试剂盒，-20℃保存。
材料与试剂
样品模板DNA的制备
取2mg～25mg动物产品，至于2mL离心管中，用剪刀尽可能剪成碎块，加入180μL的缓冲液GL、20