离子交换色谱对溶菌酶复性的色谱条件优化.doc

离子交换色谱对溶菌酶复性的色谱条件优化 刘红妮，龚波林，耿信笃 （西北大学 现代分离科学研究所/分离科学陕西省重点实验室，陕西 西安，710069） 摘要：对离子交换色谱中影响溶菌酶（Lys）复性的各个因素逐一进行考察。结果表明，当流动相中含有3.0 mol/L脲、洗脱剂(NH4)2SO4、还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比例为5:1、流速2.0 mL/min、pH 8.0、温度25 ℃时，在蛋白初浓度为20.0 mg/mL时还原变性Lys的活性回收率可达95.4%。认为此方法对蛋白的复性效率优于稀释法。 关键词：蛋白复性；溶菌酶；离子交换色谱 中图分类号：O652.63 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2004)0109-09 蛋白质折叠是生物化学中的前沿课题。它不仅涉及生命科学中生命是如何起源的重大理论问题，而且对于基因重组蛋白质的复性等应用也有十分重要的意义。传统的蛋白质复性方法有稀释法、透析法。近年来报道了一些新的复性方法，包括超滤法[1]、分子伴侣法[2]及人工分子伴侣[3,4]法、添加折叠促进剂法（如PEG[5]、L-精氨酸[6]、四氢糠醇[7]等帮助蛋白复性）及液相色谱法（LC）[8,9]。其中，LC法是近年来发展最快的复性方法之一，其优点在于利用蛋白质以单分子状态吸附于固定相上，避免或减小单个分子间的相互作用，从而达到了抑制聚集，提高活性回收率的目的。同时，在复性过程中，复性的目标蛋白还可以与大部分杂蛋白进行分离，实现了蛋白复性与纯化同时进行的目的。自1991年耿信笃等首次将高效疏水相互作用色谱（HIC）和尺寸排阻色谱（SEC）用于重组人干扰素-(（rhIFN-(）的复性及同时纯化[10,11]以来，国外科学家分别用离子交换色谱（IEC）[12]、排阻色谱法（SEC）[13,14]和亲合色谱法(AFC)[15]进行了蛋白折叠的研究，迄今已有百余篇论文发表，说明LC用于蛋白质的复性已引起广泛注意。郭立安等对LC用于蛋白质复性进行了综述[16]。 在LC复性中，由于IEC具有操作简单、操作条件温和、好的生物兼容性和高负载量等优点，是目前用LC复性蛋白研究最多的方法之一，但用于还原变性态蛋白质的复性研究还未多见。溶菌酶（Lys）有4对二硫键，复性难度大，目前Lys已经成为评估一个新的折叠方法的标准。目前，用IEC对还原变性Lys的复性研究报告的较少，李明和苏志国等利用非刚性基质的强阳离子交换色谱（SCX）在脲、pH和盐梯度的多梯度条件下提高了Lys的折叠产率[17]。本文采用硅胶基质的弱阳离子交换色谱（WCX）对还原变性Lys进行复性研究，对影响其折叠的因素，诸如流动相组成、还原/氧化谷胱甘肽比例、流速、pH值、温度逐一进行考察，经过条件优化，在蛋白初浓度为20.0 mg/mL时活性回收率可达95.38%。这表明IEC是一个强有力的复性工具，对研究重组蛋白的复性具有一定的指导意义。 1　实验部分 1.1　试剂与仪器 1.1.1　仪　器　高效液相色谱仪(LC-10A，日本岛津公司)，包括两台LC-10ATVP泵、一台SPD-10AVP紫外可见检测器、一台SCL-10AVP主机控制仪、一台CTO-10ASVP柱温箱、Rheodyne 7725手动进样阀和Class-VP色谱工作站；KQ-250型超声仪(上海昆山检测仪器厂)；CYG-100高压气动泵(北京西助技术服务中心)；紫外-可见分光光度计（UV-1601PC；日本岛津公司）；100 mm×4.0 mm I.D不锈钢色谱柱内装填弱阳离子交换填料(本实验室合成)。 1.1.2　试　剂　溶菌酶（lysozyme, Lys）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、还原型谷胱甘肽（GSH）（美国Sigma公司），DTT（华美生物工程公司，美国Amresco公司进口分装），Tris（分析纯，北京益利精细化学品有限公司，EDTA（分析纯，天津市劢特吉尔环保技术研究所），脲（urea，分析纯，中国成都金山化工试剂厂），硫酸铵(分析纯，天津石英钟厂霸州市化工分厂)，氯化钠（分析纯，沈阳化学试剂厂），考马氏亮蓝G-250（Fluka，进口分装）。 1.2　实验方法 1.2.1　还原变性Lys的制备　脲还原变性溶菌酶的制备方法见文献[18]。 1.2.2　用WCX复性还原变性的Lys　 1)流动相组成。流动相A：0.1 mmol/L Tris-HCl + 1 mmol/L EDTA + 0~5 mmol/L urea + 3.0 mmol/L GSH/0.6 mmol/L GSSG；pH 8.0。流动相B：1.0 mmol/L (NH4)2SO4+ 0.1 mmol/L Tris-HCl + 0~5 mmol/L urea +1 mmol/L