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TD9 技术：稳态动力学，荧光能量共振转移(FRET) 参考文献：Nature（2001）411，1065（FRET） Annu Rev Biochem（1998）67, 509（GFP） I． 稳态动力学概论 如有需要可复习基础生物化学课本，如 Voet Voet，Biochemistry E + S E?S E + P E = 酶，S = 底物，P = 产物 下图示产物随反应时间的变化情况 稳态时底物消耗量：[E?S]是恒定的，d[E?S]/dt = 0 稳态时的反应速度等式：v = kcat ([E0][S]/ (Km + [S])) Km = (k-1 + kcat) / k1 （定义） 注意：当[S]趋近于无穷大时，vmax = kcat [E]0 同时，当 Km = [S]时，v = ? vmax 例：如何测定 RSIle的 Km和 kcat 值： Ile + ATP + RSIle RSIle ? Ile-AMP RSIle + tRNA-Ile + AMP 共有三种底物（Ile，ATP 和 tRNA），因此有三个 Km值。要测定 Ile 的 Km值就加入过量的 ATP和 tRNA（使其饱和），然后用滴定法加入不同量的 Ile。用产物量对时间作图，根据斜 率计算其反应速度（斜率 = 反应速度）。再用反应速度对底物浓度作图，就很容易从图中 得到 Km值和 kcat值。 II． FRET（荧光共振能量转移） 该法主要用于测定两个荧光基团间的距离。 ― 此法用于当一个荧光基团（供体）的发射波长与另一个荧光基团（受体）的激发波长有 重叠时。 ― 不是重吸收方法（没有媒介光子）― 通过偶极-偶极反应染色— 两个荧光团均处于激发 状态。 ― 不产生辐射 以荧光素和罗丹明(Rhodamine)为例 荧光素：λex = 494nm，λem = 514nm（供体） 罗丹明：λex = 528nm，λem = 551nm（受体） 把两个荧光基团都连接到同一蛋白质上。 当这两个荧光基团都在 494 nm处被激发时，其发射谱出现两个峰。 要把这两个荧光基团分开，可用胰岛素消化蛋白质的方法或者通过光褪色法去除受体。 现在只有一个与供体相应的峰，因为能量不再转移给受体，其强度（I）不断增加。 FRET效率 = E = 1 – (Idonor- before blench/ Idonor- after bleach) 高 FRET = 褪色前大大增加 = 小部分 = E接近 1.0 低 FRET = 褪色前仅少量增加 = 大部分 = E接近 0 也可通过测定其寿命得到 E值 E = 1 – (τdonor- before blench/ τdonor- after bleach) 为计算两个荧光团间的距离，可应用 FRET公式得到：E = R06/ (R06 + r6) 其中 r = 供体和受体间的距离 R0 = 福斯特半径，即 E = 0.5时二者间的距离 用 E对 r作图，可以得到大多数染料在距离大约为 R0（30~60?）处的绝大多数信息— 并容 易地测定出蛋白质的直径。 对所用的某种荧光团来说，其 R0是特定的。 III． GFP— 绿色荧光蛋白 为什么？― 用特异性强的物质来标记蛋白质并可直接通过光学成像检测。 特点：源自水母（GFP = FRET aupuorin-接受器 → 将蓝光转变为绿光） 238个氨基酸 11股反平行 β-筒 Ser65-Tyr66-Gly67形成发色基团 （λex = 395 nm，λ em = 505nm， 阴离子状态 λex = 475 nm，λem = 505 nm） 饱和时间为表达后 1~4小时 氧化较慢 咪唑啉酮在空气中会发生缓慢的自氧化 在缺氧环境中不会形成荧光基团 RFP = 红色荧光蛋白 特征― 来自于珊瑚 首先变成绿色，大约 12小时后又变成红色 质谱分析显示红色蛋白质比其绿色中间体小两个质量单位 必须形成四聚体 其它设计得较为合理的颜色有：黄色（YFP），蓝色（BFP），青色（CFP） EGFP = 强绿色荧光蛋白，只有一个发射波长峰为 475nm（S65T的变异体）→ 破坏与 Glu222 间的氢键，而促进其质子化→ 以稳定 Tyr66的阴离子形式 优点— GFP由基因编码（可与待测蛋白质结合并保持完整的特异性） 缺点— 太大 GFP生色团― 参阅文