《HPLC流动相选择》.pdf

液相色谱的柱子通常正相柱和反相柱。正相柱以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3 等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基 官能团 （ODS ）称为C18 柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2 和苯基柱等。另外还有离子 交换柱，GPC 柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用： 一、反相色谱柱的选择 1．柱子的PH 值使用范围 反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时 一定要注意流动相的PH 范围。一般的C18 柱PH 值范围都在2-8，流动相的PH 值小于2 时，会导致键合相的水解；当PH 值大于7 时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。 一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果 流动相PH 较高或经常使用缓冲液时，建议选择PH 范围大的柱子，例如戴安公司的Acclaim 柱PH 2-9 或Zorbax 的PH 2-11. 5 的柱子。 2 ．填料的端基封尾 （或称封口） 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾； 含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就 好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3．戴安公司Acclaim 柱子介绍—极性封尾C16 固定相柱 戴安公司有28 种类型的柱子，Acclaim 反相柱填料高纯，金属含量极低，完全封尾。PH 2-9 范围内兼容，低流失，高柱效。尤其是2003 年推出的Acclaim 极性封尾C16 柱，是最先商 品化的磺酰氨-O 链接键的色谱柱，具极低的硅羟基活性，能在极性溶剂甚至100%水的条件 下长期使用。对酸性和碱性化合物有极为尖锐的好的色谱峰形，与现有的一流色谱柱相比有 好的立体选择性。（下图是Acclaim 极性封尾C16 柱和市售极性封尾一流色谱柱分离酸性化 合物谱图的比较） 二、液相色谱柱的使用 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变 化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件 是最佳条件)，只有样，测得的结果才有可比性。 但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。 1、样品的前处理 a、最好使用流动相溶解样品。 b 、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 - 1 - c、使用0.45µm 的过滤膜过滤除去微粒杂质。 2、流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动 相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在 柱中) 。 b 、流动相与样品不产生化学反应 c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可 运用提高温度的方法降低流动相的黏度) 。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV 检测器，最好使用对紫外 吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检 测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。 3、流动相流速的选择 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特 定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为 4.6mm 的色谱柱，流速一般 选择 1ml ／min ，对于内径为4.0mm 柱，流速0.8ml ／min 为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分 析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量) 。 注意： a ．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲 溶液作为流动相不要过 夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。 b ．流动相要求使用0.45 µm 滤膜过滤，除去微粒杂质。 c ．使用HPLC 级溶剂