骨髓间充质干细胞对小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎的治疗作用研究.doc

doi:10.6043/j.issn.0438-0479. 201604056 骨髓间充质干细胞对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠的治疗作用研究 贾春锋1*，邵林2，戴庆辰1，乐立盛2 （1. 厦门大学附属福州第二医院 福建 福州 350007；2. 福州市经济技术开发区医院 福建 福州 350007） 摘要：α和IFN-γ的mRNA水平和蛋白水平。结果显示，与对照组比较，模型组IL-1、IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ的mRNA水平和蛋白水平上调（p＜0.05），而IL-4和IL-10下调（p＜0.05）；与模型组比较，BMMSCs组IL-1、IL-2、IL-12、TNF-α和IFN-γ的mRNA水平和蛋白水平下调（p＜0.05），而IL-4和IL-10上调（p＜0.05）。对照组脊髓组织的结构正常，神经细胞形态完好；模型组脊髓组织局部出现明显空洞，而且瘢痕组织、神经细胞非常稀少；BMMSCs组脊髓组织内没有发现明显空洞及瘢痕组织，而且有大量神经细胞，可见清晰细胞胞体和突起。由上述结果可知，骨髓间充质干细胞对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠具有治疗作用，其机理与抑制炎性蛋白的表达，减少变态反应性脑脊髓炎对脊髓的损伤有关。 关键词：变态反应性脑脊髓炎；骨髓间充质干细胞；炎性蛋白 中图分类号：R-33 文献标志码：A 实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）是常见的多发性硬化（multiple sclerosis，MS）疾病，MS的发病特点是以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病[1]。严重影响患者的生活，给患者及其家属带来很大的经济和心里压力。但对这方面的研究目前并不多，需要进行详细的研究。本研究拟建立EAE小鼠模型，采用BMMSCs尾部静脉注射进行治疗，HE染色观察小鼠脊髓病理形态变化，RT-PCR和Western blot检测小鼠脊髓组织中白介素-1（IL-1）、白介素-2（IL-2）、白介素-4（IL-4）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）、白介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（IFN-γ）水平表达的变化。初步探讨BMMSCs治疗EAE的作用机制，为临床治疗MS提供新的思路和有力的实验依据。 1 材料与方法 1.1 材 料 选取雄性小鼠36只，体质量为(15.2±1.9) g，购于第三军医大学实验动物中心。DMEM培养液(广州市左克生物技术有限公司提供)；胎牛血清(赛业生物科技集团提供)；II型胶原酶(上海玉博生物科技有限公司提供)；胰蛋白及酶基质胶与Mdivi-1(美国Sigma公司)；IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的mRNA试剂盒（上海玉博生物科技有限公司提供）；BMMSCs购于杭州海瑞化工有限公司（5×106个BMMSCs 1.2 方 法 1.2.1 小鼠BMMSCs分离、纯化、鉴定及培养 将分离的脊髓组织经过磷酸盐缓冲液充分冲洗，并剔除血管后，剩余的间质组织切割成直径约1 mm大小的组织块，然后采用0.1 % II型胶原酶，0.25%胰酶37 ℃进行消化反应30 min，离心弃去上清液，剩下的组织块与细胞接种于培养皿，在DMEM培养基（含体积分数5%胎牛血清）中培养。第1次传代后每3天按1:3比例传代，进行扩增培养。取P3代细胞，消化后加人PE FITC标记的CD73、CD105、HLA-DR、CD31、VWF、KDR、CD34、CD45、CD235a流式抗体及相应对照标记，流式细胞仪检测[2]。 1.2.2小鼠EAE模型的建立 小鼠麻醉后制成实验性变态反应性脑脊髓炎模型[3]。建模成功后将36只大鼠随机分为3组，每组12只。根据分组不同进行治疗，分别为正常对照组、模型组和BMMSCs组。模型组：C57BL/6小鼠背部四点皮下注射含MOC35-55混悬液各50 μL，同时尾部静脉注射PTX 300 ng，48 h后再次尾部静脉注射PTX 300 ng加强免疫。BMMSCs组：注射前调整BMMSCs浓度为5×106 mL-1，小鼠尾部静脉缓慢注射500 μL细胞悬液，留针2 min后缓慢拔针。 1.3 评价指标 1.3.1 RT-PCR检测小鼠脊髓组织中各种炎症因子的mRNA水平 按照IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ的试剂盒说明书进行操作。制备好的电泳胶放入电泳槽，PCR产物倒入，加入缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后入电泳胶孔。μL，2.0 μL dNTP，0.4 μL上下游引物，0.4 μL Taq DNA聚合酶，1.0 μL DN