2017整理3基因工程操作程序.ppt

* 基因工程的基本内容 一、基因工程的概念 二、基因操作的工具 三、基因操作的基本步骤 1、提取目的基因 （1）从供体细胞的DNA中直接分离基因 （2）人工合成基因 获取真核细胞的目的基因一般用人工合成基因的方法 直接分离基因最常用的方法——鸟枪法 鸟枪法（散弹射击法）： 用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定发方法将目的基因的DNA片段分离出来。 人工合成基因 1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 目的基因的mRNA 单链DNA(cDNA) 双链DNA (即目的基因) 反转录 合成 人工合成基因 2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ： 蛋白质的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列 推测 推测 目的基因 化学合成 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 根据已知氨基酸合成DNA法 反转录法 鸟枪法 缺点 优点 操作简便广泛使用 工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 专一性强 操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高 专一性最强 仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 提取目的基因的新技术 1）DNA合成仪： 基因比较小，核苷酸序列又已知，可通过DNA合成仪直接合成 使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。 2）PCR技术 基因工程的基本内容 一、基因工程的概念 二、基因操作的工具 三、基因操作的基本步骤 1、提取目的基因 2、目的基因与运载体重组 目的基因与运载体重组 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 思 考？ 目的基因与运载体重组这一步骤的结果可能有哪几种情况？ 1、目的基因与目的基因结合； 2、质粒与质粒结合； 3、目的基因与质粒结合。 基因工程的基本内容 一、基因工程的概念 二、基因操作的工具 三、基因操作的基本步骤 1、提取目的基因 2、目的基因与运载体重组 3、将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入植物细胞; 将目的基因导入动物细胞; 将目的基因导入微生物细胞; 将目的基因导入受体细胞 导入的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径 导入过程：以受体细胞是细菌为例 受体细胞：细菌 CaCl2 细胞壁的通透性增大 重组质粒进入受体细胞 目的基因随受体细胞的繁殖而复制 将目的基因导入受体细胞 将受体细胞进行扩增 （三）目的基因导入受体细胞 方法： 物理：基因枪、显微注射、电激等 化学：氯化钙等（增大细菌细胞壁的通透性） 生物：病毒感染、质粒转化等 基因工程的基本内容 一、基因工程的概念 二、基因操作的工具 三、基因操作的基本步骤 1、提取目的基因 2、目的基因与运载体重组 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测和表达 目的基因的检测与表达 检测： 　 表达： 通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。 通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。 目的基因的检测和表达 　　 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 *