多克隆抗体纯化-、讲述.ppt

指导老师：陈忠正 副教授 汇报人：张晶晶 汇报内容 抗体技术的简介 多克隆抗体纯化的研究及应用 一 二 三 实验思考 一、抗体技术的简介 3 多克隆抗体的纯化技术 基因的原核表达及抗体的制备 2 抗体制备技术的发展阶段 1 1. 抗体制备技术的发展阶段： 抗体：B细胞分泌的能够特异性结合抗原的免疫球蛋白。 1890年Behring等发现抗白喉毒素抗体，开始了以抗原免疫动物来获得多克隆抗体(Pabs) 的途径 1975年 kohler等创建杂交瘤技术制备单克隆抗体(McAb) 1984年 Morrison 以基因工程方法制备基因工程抗体（GEAb） [1]甘丽晶,刘晓波,胡质毅.抗体分离纯化技术研究进展[J].检验医学与临床,2013,04:461-464. 2. 基因的原核表达及抗体的制备： 1. 盐析法 3. 多克隆抗体的纯化技术： 高浓度的中性盐，夺取抗体分子的水化层； 改变了溶液离子强度，中和抗体表面大量电荷。 中性盐有： 硫酸铵、 硫酸钠、 硫酸镁、 氯化钠及磷酸盐等。 2. 辛酸 -硫酸铵法 酸性条件（pH4.5） 往血清中加入短链脂肪酸 － 辛酸，血浆蛋白中的清蛋白、α 及 β－球蛋白成分沉淀， 取 抗体成分为主的上清液， 再经硫酸铵沉淀。 3. 亲和层析法 根据分子的特定结构部位能够同其他分子相互识别并结合的原理。 如酶与底物的识别结合、 受体与配体的识别结合、 抗体与抗原的识别结合， 改变条件可以使这种结合解除。 [1]甘丽晶,刘晓波,胡质毅.抗体分离纯化技术研究进展[J].检验医学与临床,2013,04:461-464. 1 微生物方面的研究应用 二、多克隆抗体纯化的研究及应用 2 动物方面的研究应用 3 植物方面的研究应用 4 茶叶方面的研究应用 采用盐析法、亲和层析法和抗原抗体复合物解离法获得其纯化产物 ,比较各纯化产物的比效价、纯度及交叉反应性。 1. 1. 1 比效价 测定抗血清 、各种方法纯化后抗体的效价 ,以及各自蛋白质的质量浓度 ,以每毫克蛋白质的效价作为比效价 。 1. 微生物方面的研究应用 1.1 大肠杆菌O157：H7 多克隆抗体纯化 [2]郎婧,金敏,王新为,李君文,晁福寰.大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化[J].解放军预防医学杂志,2008,04:238-241. 1. 1. 2 纯度鉴定 　 通过SDS- PAGE电泳测定抗体纯度 。亲和层析纯化法得到的抗体较纯, 其次是抗原吸附法纯化的抗体 ;而只采用盐析法所获得的抗体仍含有较多的杂蛋白 。 图1 不同纯化方法所得抗体纯度的比较 [2]郎婧,金敏,王新为,李君文,晁福寰.大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化[J].解放军预防医学杂志,2008,04:238-241. 　 以大肠埃希氏菌、阿柏 丁沙 门菌等为相似抗原, 通过观察纯化产物对相似抗原的效价与对 O157∶H7的效价比值来判断纯化产物与相似抗原的交叉反应程度。 1. 1. 3 交叉反应性 [2]郎婧,金敏,王新为,李君文,晁福寰.大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化[J].解放军预防医学杂志,2008,04:238-241. (2) 亲和层析法纯化抗体具有高效、快速 、纯化产物纯度高的优点 。但亲和层析填料成本高 、费用大 、有一定的寿命, 洗脱液可能损害目的蛋白的活性。 (3) 抗原吸附法纯化所得的抗体交叉反应明显减小 。且操作过程简单 ，得到的抗体纯度较高 , 比效价高，但损失比较大, 得率低 , 只适用于易于离心沉淀的大颗粒抗原物质如菌体抗原抗体的纯化 。 1.1.4 小结 (1)盐析法纯化的抗体纯度低，但是抗体得率很高，而且盐析法简单方便，实验设备要求低，经济实惠。 [2]郎婧,金敏,王新为,李君文,晁福寰.大肠杆菌O157:H7多克隆抗体纯化[J].解放军预防医学杂志,2008,04:238-241. 2.1 奶牛α-酪蛋白抗体纯化方法的比较及其优化? 2.1.1 盐析法和亲和层析法纯化效果比较 盐析法纯化后的α-酪蛋白比重大，仍有少量杂带；蛋白A树脂亲和层析法提纯的抗体条带清晰，杂带明显减少，抗体的纯度更高。 图2 盐析法与蛋白A树脂层析提纯比较 2. 动物方面的研究应用 [3]庞学燕,季昀,潘晓花,田青,王洪荣.奶牛α-酪蛋白抗体纯化方法的比较及其优化[J].中国奶牛,2013,02:41-42. 2.1.2盐析法结合亲和层析法纯化效果 抗血清先用盐析法粗提纯，再用蛋白A树脂亲和层析法精提纯，得到的条带清晰度最高。 图3 盐析法结合亲和层析法抗体的纯度检测 图4 Western Blot蛋白A亲和层析提纯