核蛋白抽提试剂盒(细胞和组织).doc

核蛋白抽提试剂盒（细胞和组织） 产品编号DBI-1027; DBI-1028 I. 简介: 本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的核蛋白。其原理是裂解 细胞后，利用特殊的抽提Buffer，选择性地去除细胞的胞浆蛋白和其他 蛋白；再利用低渗缓冲液分离出核蛋白。提取方法简单，可靠，快速。 获得的核蛋白纯度高，可用于PAGE电泳、Western Blot、免疫共沉淀、 EMSA等后续研究。该试剂盒所得到的蛋白溶液适合用Bradford法（ DBI 生物产品：DBI-1045,1046）蛋白定量和BCA方法（DBI生物产品：DBI- 1047,1048）进行定量。 II. 试剂盒组成: III.蛋白质抽提步骤: A. 注意事项和试剂准备: ? 打开试剂盒后，于4度保存洗液，抽提液；于-20度保存蛋白酶抑 制剂，样品缓冲液（6×）。 ? 使用前， 加10μl的蛋白酶抑制剂于1ml蛋白抽提试剂A中，使成为 蛋白抽提试剂Mix—A；加2μl的蛋白酶抑制剂于200μl蛋白抽提试 剂B中，使成为蛋白抽提试剂Mix—B； ? 在试验过程中确保抽提混合物始终保存在在碎冰中。 ? 需要自己提供的试剂：PBS. 表1a: 抽提贴壁细胞蛋白质所使用的试剂的量 试剂盒组分 DBI-1027 DBI-1028 颜色 50 次100 次 蛋白抽提试剂A 蛋白抽提试剂A-1 蛋白抽提试剂B 蛋白酶抑制剂 样品缓冲液（6×） 50 ml 12.5 ml 12.5 ml 1 vial 5 vial 100 ml 25 ml 25 ml 1 vial 10 vial 无色 无色 无色 棕色 白色 表1b: 抽提悬浮细胞、组织样品和冷冻细胞蛋白质 所使用的试剂量 B. 蛋白质抽提步骤: 培养细胞 1、收集不少于1×107 细胞，用冷PBS 洗涤细胞两次（每次3000 rpm 离 心5 min）；为保证得率，对于贴壁细胞，最好将细胞消化后，收集细 胞。 2、在上述细胞沉淀中加入蛋白抽提试剂A-MIX 800μl，置冰浴中5 分钟。 再加蛋白抽提试剂A-1 200μl，混匀后，于漩涡混合器中震荡20 秒中， 于4℃,保持10 分钟。3000 rpm ，4℃离心10 min，弃上清； 3、取蛋白抽提试剂B-MIX 100 μl 加入离心管中，重悬沉淀，于漩涡混合 器中震荡20秒中，于4℃,保持30分钟。14 000 rpm，于4℃,离心2 min， 上清转至新管中，为核蛋白，冷冻保存； 组织样品（适用于100—200mg组织） 1. 按照常规方法进行组织样品的收集，用PBS清洗细胞或组织样品23 次；将组织样品中所含有的血块洗掉。 2、在上组织样本中加入蛋白抽提试剂A-MIX 800μl，置玻璃均浆器冰上匀 浆30～50 次。时间约为2 分钟。对于柔软性组织样品（如肝组织，心脏组织，肾脏组织，脑组织等） 采用匀浆的方法进行，冰水混合物中彻底匀浆（一般为1分钟，中间每 隔20秒停顿3秒中，匀浆转子中速）。 对于硬度比较强的组织样品（如软骨，肌腱组织等），则采用在冰中 研磨的方法。 3、将匀浆液转移至冷的离心管中，4℃于500g离心10分钟。弃去沉淀， 收集上清。 4、将匀浆上清液转移到离心管中，加入蛋白抽提试剂A-1 200μl。于漩涡 混合器中震荡20 秒中，于4℃,保持10 分钟。3000 rpm，4℃离心10 min，弃上清； 5、取蛋白抽提试剂B-MIX 100 μl 加入离心管中，于漩涡混合器中震荡20 秒中，于4℃,保持30 分钟。14 000 rpm，于4℃,离心2min，上清转 至新管中，为核蛋白，冷冻保存； SDS——PAGE 电泳操作步骤 进行电泳前，取该提取物，加入6×Loading Buffer，煮沸10 分钟。上 样进行SDS—— PAGE 电泳。