实验9硝酸还原酶活性的测定.doc

实验9 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。 二、材料用具及仪器药品 木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2 标准溶液： a—萘胺试剂配制：0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml. NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。 磷酸缓冲液： 贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1000ml）。 贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或Na2HPO4·12H2O 配成1000ml） 取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml 三、原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO—3还原于NO—2 NO—3+NADH+ NO—2+NAD++H2O 产生的NO-2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。 NO-2含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。 四、方法步骤 1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO-2含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmol/L 的 3—磷酸甘油醛或1.6——二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。 2．NO-2含量的测定 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用分光光计进行比色测定，比色时用520nm波长，记下光密度，从标准曲线上查得NO-2含量，然后计算酶活性，以每小时每克鲜重产生的NO-2表示之。 3．绘制标准曲线 测定NO-2的磺胺比色法很灵敏，可以检出低于1ug/ml的NaNO2含量，可于0～5ug/ml浓度范围内绘制标准曲线。 吸取不同浓度的溶液（例如5、4、3、2、1、0.5ug/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及一萘胺试剂2ml。混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水浴中保温30分钟）立即于分光光色计下进行比色，（波长520nm），读取光密度，然后，以光密度为纵坐标，NO-2浓度为横坐标，于毫米方格纸上绘制光密度——浓度曲线。 五、实验报告 计算所测材料硝酸还原酶的活性。 六、思考题 1、试比较不同植物的硝酸还原酶活性。 2、试比较取样前植物处于光照或黑暗条件下酶活性有什么不同。 附表： xmlA+ymlB.稀释至200ml PH x Y pH x Y 5.7 5.8 5.9 6.0 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 93.5 92.0 90.0 87.7 85.0 81.5 77.5 73.5 68.5 62.5 56.5 51.0 6.5 8.0 10.0 12.3 15.0 18.5 22.5 26.5 31.5 37.5 43.5 49.0 6.9 7.0 7.1 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 45.0 39.0 33.0 28.0 23.0 19.0 16.0 13.0 10.5 8.5 7.0 5.3 55.0 61.0 67.0 72.0 77.0 81.0 84.0 87.0