2011-5 第七章 色谱.ppt

7.9 亲和色谱法（ Affinity Chromatography ，AC） 7.9.1 原理 亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。 7.9.2 AC分离类型的选择 (1)根据相对分子质量选择 相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液-固、液-液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O-2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用SEC为佳。 (2)根据溶解度选择 弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水井属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳 用液-固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液-液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。 7.10 高速逆流色谱技术(HSCCC) 高速逆流色谱技术(high-speed countercurrent chromatography，简称HSCCC) 是20世纪80年代由美国Y. Ito博士发明的一种新的逆流色谱技术。它是基于液-液分配原理，利用螺旋管的方向性与高速行量式运动相结合，产生一种独特的动力学现象，使两相溶剂在螺旋管中实现高效地接触、混合、分配和传递，因而无须任何固体载体或支撑体，能达到在短时间内实现高效分离和制备。具有分离效率高、超载能力强、溶剂用量少的优点，克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形施尾等缺点，应用范围广，特别适用于极性化合物的分离。据文献报道，已在生物碱、黄酮、萜类、木脂素、香豆素等成分的研究中获得成功。 7.11 圆二色谱Circular Dichroism (CD) 圆二色光谱仪通过测量生物大分子的圆二色光谱从而得到生物大分子的二级结构。 可应用于：蛋白质折叠﹑蛋白质构象研究, DNA/RNA反应, 酶动力学, 光学活性物质纯度测量, 药物定量分析。天然有机化学与立体有机化学, 物理化学, 生物化学与宏观大分子, 金属络合物, 聚合物化学等相关的科学研究。 圆二色光谱：研究稀溶液中蛋白质构象，快速、简单、较准确 （1）确定蛋白质构象最准确的方法是x-射线晶体衍射，但对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说，得到所需的晶体结构较为困难。 （2）二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白质的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂。 7.11.1 圆二色光谱的原理 当平面偏振光通过具有旋光活性的介质时，由于介质中同一种旋光活性分子存在手性不同的两种构型，故它们对平面偏振光所分解成的右旋和左旋圆偏振光吸收不同，从而产生圆二色性． 圆二色性的表示  椭圆度?，摩尔椭圆度[?]  ?=2.303(AL – AR)/4 [?] = 3298(?L - ?R)?3300 (?L - ?R) 在蛋白质研究中， 常用平均残基摩尔椭圆度 圆二色仪原理 The peptide bond is inherently asymmetric is always optically active 7.11.2. 应用：蛋白质的光学活性 Near UV-CD spectrum 蛋白质中芳香氨基酸残基，如色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区250～320 nm，表现出CD信号。 Phe残基: 255、261和268 nm附近；Tyr残基:277 nm左右；而在279、284和291 nm是Trp残基的信息；二硫键的变化信息反映在整个近紫外CD谱上。 近紫外CD谱可作为一种灵敏的光谱探针，反映Trp、Tyr和Phe及二硫键所处微环境的扰动，能用来研究蛋白质三级结构精细变化。 Near UV CD spectrum of Lysozyme Main CD features of protein 2ndary structures - band (nm) + band (nm) α-helix 222 208 192 β-sheet 216 195 β-turn 220-230 (weak) 180-190 (strong) 205 polypro II helix 19