SN_T 4348-2015螯虾瘟检疫技术规范.pdf
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SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4348—2015螯虾瘟检疫技术规范Quarantine protocol for crayfish plague2015-12-04 发布2016-07-01实施中华人民共和国发布0国家质量监督检验检疫总局刮涂屋查真优
SN/T4348—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准修改采用世界动物卫生组织(OIE)《水生动物疾病诊断手册》(2014年版)的2.2.1,主要修改如下:原文格式及内容顺序排版上作了调整,按照GB/T1.1—2009进行编写;原文中“Diseaseinformation”内容经修改简缩后作为本标准附录A;-删除了原文“4.2.Clinical methods内容;原文.3.1.普通PCR上游引物(B042)序列为5-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTTCF-3’。该引物序列3末端有误。经与OIE参考实验室专家确认,正确的引物序列为5GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3;增加了实时荧光PCR方法Ct阈值的描述;-对原文“7.Corroborativediagnosticcriteria”的表述形式进行了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人:贾鹏、史秀杰、王津津、于力、郑晓聪、何俊强、兰文升、刘、陈兵、王红英、叶奕优。
SN/T 4348—2015螯虾瘟检疫技术规范1 范围本标准规定了螯虾瘟的临床症状、病原分离、普通PCR和实时荧光PCR检测方法。本标准适用于螯虾瘟的诊断、流行病学调查和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样GB19489实验室生物安全通用要求3概述螯虾瘟(crayfish plague)是由Aphanomycesastaci感染十足目螯虾科和刺科螯虾的一种水生动物传染性疾病。A.astaci属于藻界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、硅藻和褐藻类(Diatoms和Brownalgae)。根据Aastaci对宿主的易感程度,检疫对象分为北美螯虾和高度易感螯虾两大类。北美螯虾是指野生或鼻殖于北美地区的所有种类鳌虾,是A.astaci的自然携带者,被感染后通常无临床症状或死亡。高度易感整虾是指除北美螯虾外,对A.astaci易感且易出现临床症状或死亡的螯虾(参见附录A)。4缩略语下列缩略语适用于本文件。ITS:核糖体DNA内转录间隔区(internal.transcribedspacer)ITS1 :核糖体 DNA 内转录间隔区 1(internal transcribed spacer 1)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)CTAB:十六烷基三甲基溴化胺(cetyltrimethyl ammoniumbromide)UNG:尿嘧啶-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase)Ct:循环阈值(cyclethreshold)5仪器和设备5.1倒置显微镜。5.2冷冻离心机。5.3微量移液器。5.4PCR扩增仪。
SN/T4348—20155.5实时荧光PCR仪。5.6水平电泳仪。5.7凝胶成像仪。5.8超净工作台。5.9恒温培养箱。5.10二级生物安全柜。6试剂和材料6.1水:符合GB/T6682中一级水的规格。6.2螯虾瘟菌株:由指定单位提供。6.3无水乙醇,分析纯,使用前预冷至一20℃。6.470%乙醇。6.5DNA聚合酶:一20℃保存,避免反复冻融或温度剧烈变化。6.6 dNTPs:含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP。6.7螯虾瘟普通PCR检测引物BO42/BO640:上游引物 B0 42:5-GCT-TGT-GCT-GAG-GAT-GTT-CT-3;-下游引物B0 640:5-CTATCC-GAC-TCC-GCA-TTC-TG-3;扩增A.astaciITS基因中大小为569bp片段。6.8螯虾瘟普通PCR复核引物TS1/TS4:上游引物TSl:5-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GCG-G-3;下游引物TS4:5-TCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC-3;扩增A.astaciITS基因中大小为757bp片段。6.9实时荧光PCR引物及探针:上游引物AphAstITS-39F:5-AAG-GCT-TGT-GCT-GGG-ATG-TT
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