NP-HPLC法测定重组肿瘤坏死因子单克隆抗体寡糖含量的研究_490.doc

NP-HPLC法测定重组肿瘤坏死因子单克隆抗体寡糖含量的研究 程速远，毛歆，李晶，梁成罡 （中国药品生物制品检定所 北京 100050） 摘要 目的 研究肿瘤坏死因子单克隆抗体寡糖含量测定方法。 方法 采用N-聚糖酶酶解消化后释放出寡糖，释放出的寡糖可以被一种荧光标签2-氨基苯甲酰胺（2-AB）进行标记，标记后的寡糖可用正相高效液相色谱（NP-HPLC）方法进行分离，用荧光检测器进行检测。 结果 二天线果糖寡糖含量分别为87%，89%，87%，寡甘露糖含量分别为3%，3%，3%。结论 本方法可用于寡糖的含量测定方法，灵敏度高，重现性好。 关键词：寡糖 2-AB标记 NP-HPLC法 Study on determination of the oligosaccharide of a recombinant monoclonal antibody by NP-HPLC CHENG Su-yuan , MAO Xin, LI Jing, LIANG Cheng-gang Abstract Objective: To establish an NP-HPLC method for the determination of adalimumab with pre-column derivatization． Methods: Oligosaccharides in adalimumab are released by PNGase F and derivatised with 2-AB. The derivatives were then separated by NP-HPLC with ProPacWCX-10Can（250mm×4.0mm，10um ）.The column temperature was 30℃，with fluorescence detector and the excitation wavelength at 330nm; emission wavelength at 420nm．Results：Fructooligosaccharides are 87%,89% and 87% and oligomannose are 3%,3% and 3% respectively. Conclusion：The method sensitive, specific and reproducible. It can be applied to quantitative determination of oligosaccharide in adalimumab. 重组肿瘤坏死因子单克隆抗体（adalimumab）是用于治疗类风湿性关节炎重组DNA技术生产能够识别结合并阻断肿瘤坏死因子(TNF) nm，发射波长为420 nm。记录色谱图。色谱图见图1。 1、NGA2F-GlcNAc 2、NGA2F 3、M5 4、NA1F 5、M6 6、NA2F 2.2 N-聚糖酶酶解 对照品溶液制备：吸取对照品50ul置0.5ml离心管中，加入制剂缓冲液12ul，混匀，即得。供试品溶液制备：取供试品50ul，加入制剂缓冲液325ul，混匀即得。对照品溶液和供试品溶液各取40ul分别置两个离心管中，每管中加入10%TritonX-100 5ul，G710ul,N-聚糖酶4ul，纯水41ul，使总体积达到100ul，混匀。37℃摇床150rmp转速振荡18h。 酶解后产物置95℃加热块加热5min，隔一分钟振荡使蛋白沉淀，各管以1000rmp的转速离心5min，将50ul各管上清液转入1.5ml离心管中，离心浓缩仪冷冻干燥2h。 2.3 2-AB标记 向上步干燥后样品中加入5ul2-AB试剂，充分混匀，离心甩打，65℃水浴孵育3h，离心甩打，放冷。将上述标记后样品用GlycoClean S萃取小柱进行洗脱，（GlycoClean S萃取小柱先后用1ml水、5ml 30%乙酸溶液、3ml乙腈和1ml乙腈冲洗，上样后先用1ml乙腈冲洗一次，再用1ml 96%乙腈溶液冲洗5次，滤液弃去。0.5ml水洗脱3次，滤液用1.5ml离心管收集，离心浓缩仪冷冻干燥至体积约为0.8ml。 2.4 NP-HPLC色谱条件 色谱柱：GlykosepTM N-Plus色谱柱（4.6mm×150mm）））