噬菌体随机肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定的论文.doc

噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定的论文 【摘要】 目的： 从噬菌体随机12肽库中筛选能与抗血管内皮生长因子(vegf）mab阿瓦斯汀(avastin)特异性结合的多肽. 方法： 用avastin为靶分子，对噬菌体12肽库进行3轮生物淘洗，随机挑取80个克隆，elisa法鉴定其亲和性，将亲和性高的阳性克隆进行dna序列测定，推导与噬菌体外壳融合的12肽氨基酸序列. fmoc固相法合成12肽，戊二醛交联12肽与血蓝蛋白（klh），打点印迹（dot blot）检测偶联物能否与avastin 结合. 结果： elisa显示，42个噬菌体克隆与avastin有较强的亲和性，测序发现41个阳性克隆表达的融合12肽的序列一致，1个不同；化学合成的12肽能与avastin特异性结合，12肽klh偶联物也能与avastin特异性结合. 结论： 初步证明12肽模拟了vegf部分表位. 【关键词】 avastin(bevacizumab) 细菌噬菌体 肽库 血管内皮生长因子 交联 　0引言 　　血管生成是肿瘤生长和转移的前提［1］. 血管内皮生长因子(vegf) 是促进血管形成过程中的关键因子［2-3］.肿瘤组织中vegf表达水平与肿瘤血管化的程度、恶性程度呈正相关［4-5］. 因此，vegf是肿瘤抗血管生成治疗中比较理想的靶分子. 噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为任何靶抗原表位的模拟肽，运用肽库筛选时不需要靶蛋白的任何结构，只需靶抗原的mab就可以获得具有免疫原性和抗原性的多肽，它们反映了抗原结合位点的特定的构像 ［6-7］. 我们利用抗vegf mab 阿瓦斯汀（avastin）对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选，旨在筛选出能与avastin有高亲和力的噬菌体克隆，并分析其展示的多肽序列能否模拟vegf的表位. 　　1材料和方法 　　1.1材料抗vegf mab avastin(罗氏公司)；噬菌体随机12肽库（新英格兰生物公司）；peg8000（华美生物公司）；iptg,xgal、辣根过氧化物酶（hrp）标记的抗噬菌体单克隆羊抗体(hrpantim13，皮尔斯生物技术公司）；血蓝蛋白（klh，西格玛公司）. 550型elisa读数仪（美国伯乐公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1vegf模拟表位肽的筛选 　　1.2.1.1噬菌体库的生物淘洗用100 g/l avastin 150 μl包被96孔板的1个孔，4℃过夜，封闭后加入100 μl tbst稀释10 μl 12肽库，室温作用1 h，用1 ml/l tbst冲洗10次. 加入洗脱液(0.2 mol/l glycinehcl,1 g/l bsa)100 μl作用8 min，吸出洗脱液，再用1 mol/l trishcl 15 μl中和上述洗脱液. 吸取1 μl洗脱液测定滴度，其余液体加入20 ml lb培养基（含er2738 200 μl，四环素贮液20 μl）进行扩增和纯化. 按以上步骤进行第2,3轮筛选，但分别用3，5 ml/l tbst洗涤. 　　1.2.1.2阳性噬菌体的鉴定第3轮筛选完成后，挑选80个分割良好的噬菌体克隆分别进行扩增和纯化. 将纯化好的噬菌体分别加入预先包被了avastin和人il15 mab（阴性对照）的96孔板中，室温作用1 h；加入hrp标记的抗m13（1∶2000）抗体，作用1 h. opd显色，测定a490 nm值，以a490 nm值高于阴性对照2.1倍作为阳性克隆. 　　1.2.1.3阳性噬菌体与avastin结合的剂量依赖实验以5 mg/l avastin包被96孔板,每孔100 μl，同时对每个avastin包被孔设立il15 mab的包被孔为阴性对照，4℃孵育过夜. 加入封闭液（5 mg/l bsa,0.1 mol/l nahco3, ph 8.6），4℃封闭2 h，将阳性噬菌体稀释至5×1014pfu/l后作倍比稀释（pfu：噬菌斑形成单位），直至其滴度为1.9×1010pfu/l ，分别加入avastin及il15 mab包被孔，100 μl/孔，室温孵育2 h，每孔加入hrp标记的小鼠抗m13噬菌体mab（1∶5000）100 μl，室温孵育1 h，opd显色后测定a490 nm值. 　　1.2.1.4阳性噬菌体单链dna的提取及测序取500 μl上述噬菌体贮液，加入200 μl peg8000/nacl放置10 min，离心10 min，弃上清，沉淀重悬于100 μl碘化物缓冲液中，加入250 μl乙醇，室温作用100 min，离心100 min，弃上清，用700 ml/l乙醇洗沉淀，短暂真空干燥. 沉淀重悬于30 μl te(0.01 mol/l trishcl，1 mmol/l