第四章 动物组织细胞培养.ppt.ppt

1111 防止污染、无菌操作是动物组织培养成功的关键！ 1）培养前准备：制定实验计划和操作程序。 2）超净台要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30分钟，工作台面上用品不要过多或重叠放置。 3）个人进入无菌培养室原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装，开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁而灭消毒手和前臂。 4）实验中需保持无菌操作要求。实验前要点燃酒精灯，烧过的器械要注意冷却，以防细胞损伤。 5）分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液，而不能混用 6）不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰灼烧或取备用品更换。 7）注意操作时勿大声讲话或咳嗽。 基本概念 分类： 器官培养 组织培养 细胞培养 定义： 动物细胞培养是指将动物的某一组织如肝脏、肺、肾脏等组织取出，使其分散成单个细胞，在人工条件下(无菌、适当温度和一定营养条件下)，使之存活、生长和增殖的技术 。 基本概念 定义： 动物组织培养(tissue culture)是指从动物体内取出组织并模拟体内生理环境，使之在体外人工条件下生存和生长，并维持其结构和功能不变的技术。 器官培养(organ culture)的培养对象是整个器官、器官的一部分，是在模拟体内的生理环境，使之在体外存活、生长和保持一定功能的技术。 基本概念 4.1动物细胞体外培养环境 4.1.1 温度 4.1.2 pH 4.1.3 渗透压 4.1.4 气相 4.1.5 生长基质 4.1.1 温度 无论来源于何种有机体的细胞培养都需要一个与体内生存环境尽可能一致的生长条件，其中最基本的条件之一是恒定的适宜的温度环境 。 人和大多数哺乳动物培养细胞的最适温度在37℃左右。培养细胞对低温的耐受力比对高温强。 4.1.1 温度 细胞培养在39～40℃中1 h，即会受到一定损伤，但仍能恢复。当在41～42℃的温度条件下培养1 h，细胞则会受到严重损伤，但不致于全部死亡，部分仍可能恢复。当温度达43℃以上时，细胞大多死亡。 温度低于正常范围的环境，总的来说，只要温度不低于0℃时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害作用。 4.1.2 pH 细胞内、外pH调节是哺乳动物细胞和机体生存的基本条件。pH不仅对维持离子平衡，而且对保持细胞的最佳酶功能状态和激素及生长因子对细胞表面受体的亲和力都很重要。 4.1.2 pH 大多数培养液设计的pH为7.0～7.4，最适宜是7.2，不同的细胞类型可能有一个小的最适pH变化范围，细胞能够耐受pH在这个范围内的偏离，大多数细胞能耐受的培养液pH范围为6.8～7.6，超出这一范围会致死细胞。 4.1.3 渗透压 渗透压；260－320mOsm/kg适用于大多数细胞。 4.1.4 气相 O2(oxygen)参与细胞的能量代谢，为细胞生命活动提供能量； CO2(carbondioxide)主要与维持培养液的酸碱度有直接关系 。 大多数体外培养的气相环境为含5％的CO2和95％空气的混合气体，其中氧浓度为21％[21.3 kPa(160mmHg)]。必要时，可通人N2以稀释O2，调节培养箱内O2的浓度。 4.1.5 生长基质 在体内条件下，大部分细胞贴附于结缔组织、基膜或矿物基质(如骨组织)。仅有血液、淋巴和其他液体内的细胞能够在悬浮状态下生长。 多聚赖氨酸 纤维连接蛋白 层粘连蛋白 胶原 亲玻粘连蛋白 韧粘素 人工膜 饲养层 4.2动物细胞体外培养方法 4.2.1原代培养与传代培养 4.2.2动物细胞培养的方法 4.2.3动物细胞大规模培养技术 4.2.1原代培养与传代培养 大多数体外培养的动物细胞都需要贴附于适当的基质上才能生长，细胞的这种特性叫做贴壁依赖性(anchorage-dependent)。依据细胞的生长是否需要贴壁，动物细胞体外培养又可分为两类：贴壁培养(adherent culture)和悬浮培养(suspension culture)。 4.2.1原代培养与传代培养 在动物细胞体外培养中，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为原代培养或称初代培养(primary culture)和传代培养(subculture)，传代培养又称继代培养(secondary culture)。 4.2.1原代培养与传代培养 原代培养是从机体取得材料开始，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，直到第一次传代前的这一培养过程。 原代培养的培养物的结构形式分为两种，一种是利用小块组织或称为组织块(tissue block)进行培养，另一种是将机体组织分散后制成单细胞进行培养（酶消化法）。 4.2.1.1原代培养 组织块原代培养 4