【2017年整理】NEB-T4 DNA Lagase注意事项.docx

一、关于NEB M0202 T4 DNA 连接酶的使用方法和常见问题及解答1、产品特性和使用方法产品说明：该酶催化契合的双链DNA或RNA的5-磷酸末端和3-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口(1)。来源： 源于E.coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 (2)。应用：限制性酶切片段的克隆 (3)。将linker或adapters 连接到DNA片段的平滑末端。反应缓冲液： 1X T4 DNA Ligase Buffer:[50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA, (pH 7.5 @ 25°C)]。推荐DNA浓度(0.1 - 1 μM 的5′末端)。使用注意：ATP是反应必须的辅因子。这一点与要求NAD作辅因子的大肠杆菌DNA连接酶不同。如在反应体系中补加1 mM的ATP，连接反应还可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液(NEBuffers)或在T4 DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。质量保证： 无核酸内、外切酶污染。每批T4 DNA连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出待连接DNA末端的任何破坏。结果表明99.9%的DNA末端未受任何降解。单位定义(粘性末端活性单位）：在20μl连接反应体系、0.12μM (300μg/ml)的5-末端浓度条件下，16°C反应30分钟，能使50% 的经Hind Ⅲ消化的λDNA片段连接所需的酶量定义为一个NEB单位。一个粘端连接活性单位=0.015个韦氏（ATP-PP交换）单位(4)。一个韦氏单位=67个粘端连接活性单位。浓度：400,000 units/ml和2,000,000 units/ml。贮存条件： 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 μg/ml BSA和50%的甘油，-20°C贮存。热失活条件: 65°C 加热10分钟。室温连接反应：为方便起见，连接反应可以在室温（20-25°C）条件下进行。粘性末端连接：在20μl反应体系中加入1μl T4 DNA连接酶，反应10分钟。平滑末端连接：在20μl反应体系中加入1μl T4 DNA 连接酶反应2小时，或者加入1μl高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。另外，NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V [15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。图1：在25°C条件下，用1 unit（1:400稀释后取1 μl）T4 DNA连接酶连接λDNA/Hind Ⅲ片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图2：在20 μl反?μ逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。 图2：在20 μl反?μ逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的λDNA/Hae Ⅲ片段。16°C温育30分钟。 二、常见问题及解答Q1：有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败?A1：???反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。???反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。???去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。???DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10μg/ml之间。???连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5μl高浓度连接酶16°C过夜连接。???插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。???加入过多的连接混合物至感受态细胞：50μl感受态细胞应加入1-5μl连接混合物。???插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16°C过夜连接。???连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。???连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连