大黄素甲醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用.doc

大黄素甲醚预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的神经保护作用 梅利1，廖仁昊2，梁容仙2，王敬2 （1.西宁市第一人民医院神经内科，青海 西宁 810000；2.保定市第一医院神经内科，河北 保定 071000）36只，体重250g~320g，由青海医学院实验动物中心提供。 随机分为3组。A组为：假手术组。B组为：脑缺血再灌注组， 2h大脑中动脉阻塞(MCAO), 再灌注22h后处死。C组为：大黄素甲醚预处理组, 大黄素甲醚(由山东新华制药股份有限公司提供批号：0506338） 60mg?kg-1·d-1溶于2ml生理盐水中，灌胃3次，3天后造成2hMCAO，再灌注22h后处死。给予A、B组等量生理盐水灌胃。 2．缺血再灌注模型制作　采用Zea-longa等[4] 的大脑中动脉线栓法并加以改进(原方法只结扎左颈外动脉未切断)。以10%水合氯醛(0.35ml/100g)腹腔注射麻醉大鼠。然后分离出左颈外动脉、颈内动脉及分叉处，结扎左颈外动脉并切断左颈外动脉及其分支，将左颈外动脉残端下拉与颈内动脉呈一条直线，在左颈外动脉残端剪一小口，插入一根顶端粘有石蜡的尼龙丝线（直径0.20mm）。向上深入至颈总动脉分叉以上19~21mm阻断大脑中动脉造成大脑中动脉缺血（MCAO），2h后将尼龙线抽出形成再灌注，22h后行神经功能缺失评分后断头处死。动物模型成功的标志是MCAO后同侧即刻出现Honer征, 动物清醒后爬行时向右转圈，严重时向右跌倒，提尾时右前肢内收屈曲且一直存活到再灌注22小时。假手术组除不插入顶端粘有石蜡的尼龙丝线外，其他操作步骤同上。 指标检测及方法 1. 神经功能缺失评分 按Longa等[4]的5级评分法评分：0级，无功能障碍；1级,不能伸展右侧前肢；2级，向右侧旋转；3级，向右侧倾倒；4级，无自主活动伴意识丧失。 2． 血清神经元烯醇化酶(neuron specific enolase, NSE)的测定： 神经功能缺失评分完毕后，取心脏血2ml，离心后取血清，置-20℃冰箱内保存，整批待测，按照NSE-ELISA（试剂盒为美国Linco公司所提供）试剂盒说明操作测定，单位为ng/ml。 3． 脑梗死体积测定： 取血完毕后，每组各随机选取6只动物，以10%的水合氯醛深麻醉后处死。取左侧大脑半球，冠状面均匀切成2mm厚脑片，迅速放入2%的TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)溶液(37℃)中染色30min，然后用10%的福尔马林缓冲液固定。24h后照相，测量每个层面梗死灶面积，将各脑片梗死面积之和乘以厚度(2mm)为总的梗死体积。 4. 脑组织白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)含量测定: 每组另外6只动物用10%的水合氯醛深麻醉后处死，迅速取出鼠脑，剥离左侧皮质，称重后按400mg:1ml加生理盐水制脑组织匀浆，匀浆液3000r/vpm低温离心15min，取上清液置-20℃冰箱内待测。采用FT-DFγ-晶体闪烁计数仪(北京核仪器厂生产)，测定脑组织IL-1β和TNF-α的含量。试剂盒均由解放军总医院科技开发中心放免所提供。其结果以ng/ml表示。 4 .统计学处理 数据用均数±标准差(±s)表示，用SPSS10.0统计软件处理，多组比较进行方差分析及两两比较q检验，两组间比较采用t或t’检验。 结果： 1.神经功能缺失评分：假手术组无神经功能缺失表现，脑缺血再灌注组大鼠均表现不同程度的神经功能缺失。Ply处理组神经功能缺失评分降低，与缺血再灌注组比较有显著性差异(p0.01)。见表1。 2.血清NSE含量：脑缺血再灌注组血清NSE含量与假手术组比较明显升高 (P0.05)。Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较血清NSE含量降低(p0.01)。见表1。 3.脑梗死体积：假手术组无肉眼可见的梗死灶形成。脑缺血再灌注组大鼠均表现不同程度的梗死灶形成。Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较梗死体积缩小(p0.01)。见表1。 4.脑组织IL-1β和TNF-α含量：脑缺血再灌注组脑组织IL-1β和TNF-α含量与假手术组比较明显升高(P0.01)。Ply预处理组与脑缺血再灌注组比较病变侧脑组织IL-1β和TNF-α含量降低 (p0.05)。见表2。 表1各实验组神经功能缺失评分、血清NSE含量、脑梗死体积的比较(n=12 ±s ng/ml) 组别 神经功能缺失评分 NSE 脑梗死体积 假手术组 0 3.42±0.27 0 脑缺血再灌注组 2.89±0.21 13.48±0.68* 181.54±17.12 P预处理组 2.06±0.24# 10.46±0.95# 132.60±12.14# * 与假手术组比较, P0