【2017年整理】Dimer X二聚体抗原呈递技术.doc

探索抗原特异性T细胞应答的新工具——Dimer X抗原呈递技术 简单易行的3步曲：加载抗原-染色-分析 前言 主要组织相容性复合物（MHC）基因座编码一组高度多型的细胞表面蛋白，后者在机体对抗原的免疫应答中发挥关键作用。MHC分子通过结合和向T细胞抗原特异性受体（TCR）呈递抗原片段发挥功能。人(人白细胞抗原 / HLA)和小鼠(组织相溶性抗原2/ H-2）MHC分子是在结构和功能上都具有相关性的蛋白质，主要包括两种类型。 MHC I类分子包含两个多肽链。α链是由MHC编码的跨膜多肽，含有三个胞外结构域：α1，α2和α3。第二条链包含一个非MHC编码的多肽－β2微球蛋白（β2M）。由于β2M不具有跨膜结构域，它与α链通过非共价作用连接。外源性Ag经水解形成的肽段与MHCⅠ分子结合，形成Ag/MHCⅠ复合物继而表达在细胞膜上，被CD8＋T细胞（TC细胞）的T细胞受体识别，产生CTL（细胞毒性T细胞）免疫。 MHC II类分子包含两个不同的跨膜蛋白，结合外源性抗原（如细菌和真菌）衍生而来的肽段，并被CD4+T细胞特异识别。内源性Ag经水解形成的肽段与MHCⅡ分子结合，形成Ag/MHCⅡ复合物继而表达在细胞膜上，被CD4＋T细胞（TH细胞）的TCR识别，诱导辅助性T细胞免疫。CD4和CD8辅助分子与MHC分子的非多形区相互作用而稳定TCR -MHC复合体的形成。 机体受到抗原刺激后产生免疫应答，通过复杂的免疫反应最终清除抗原，保护机体。特异性免疫反应都是由Ag在MHC帮助下被呈递给T细胞，同时协同刺激分子传递T细胞活化的协同刺激信号到核内，从而T细胞活化、扩增并分化为效应细胞，产生效应分子，杀伤受感染细胞、癌细胞，清除病原体。MHC不仅与移植排斥反应有关，也广泛参与免疫应答的诱导与调节。 近来，在疫苗开发和特异抗原免疫应答等研究领域，以可溶性二聚体蛋白经免疫荧光鉴定和流式细胞术分析抗原特异性T细胞显示出越来越重要的作用。BD PharMingen开发的DimerX技术的是基于MHC对抗原肽的自然免疫处理，这种处理是刺激抗原特异性T细胞所必需的。DimerX试剂是由重组的可溶性MHC:Ig蛋白及b2M共同組成。适用于免疫荧光染色以及流式細胞仪分析。DimerX技术 BD PharMingen通过DNA重组技术将编码MHC I类分子的3个胞外结构域的cDNA插入小鼠IgG1重链基因可变区，再将含有融合基因的表达载体与人b2M基因共转染到一个IgG重链缺陷型鼠浆细胞瘤细胞系J558L，细胞的分泌产物是由重组的MHC:IgG1重链融合蛋白和以二硫键结合到重链的轻链，以及以非共价键与MHC结合的b2微球蛋白形成的复合物。该重组分子有2个抗原片断结合沟，研究者可自行加载任意感兴趣的抗原片断，再以PE标记的anti-Ms IgG1与MHC:IgG1结合，经免疫荧光染色或流式細胞仪分析呈桔黄色荧光。以FITC标记的anti-CD8染色CD8＋T细胞，经FCM分析呈绿色荧光。由此，同时呈现桔黄色和绿色荧光的细胞即为针对目标抗原与MHC I复合物的特异杀伤性T细胞。 BD PharMingen DimerX产品特性： 鉴定Ag/peptide特异性T细胞 模拟特异性的MHC-Ag-TCR相互作用 具有功能性的DimerX易于加载研究者感兴趣的任意抗原肽 高亲和力的DimerX加载肽后能与相应的抗原特异性T细胞长时间稳定结合 IgG的铰链区的可运动性使连接在臂上的MHC与TCR更加自由、灵活的结合 大大增强了其结合抗原特异性T细胞的功能 实验流程（3步法） 加载抗原肽段（无菌操作）1.1 制备目标抗原肽段贮存液：将肽段溶于DMSO制成20mg/ml stock液，可以小量分装冻存于－20℃。至使用时，以无菌的PBS稀释至2mg/ml即可。1.2 肽段与DimerX混合于PBS(0.2%BSA) pH7.2 (554657),肽段过量比例40, 160, 640.（肽段为 8-10 aa,纯度95%（HPLC））肽段用量Mp (mg)可用此公式估算：Mp=Md×R×Dp/DdDp＝肽段分子量(dalton)， Dd＝250,000 daltons，R＝过量肽与Dimer的摩尔比(40,160, 640)，Md＝Dimer用量 （H-2Kb,d:Ig为0.25~4 mg/106 cells/ test，HLA-A2:Ig为1~2 mg /106cells/test）1.3 肽段与Dimer X混合液于37℃孵育1 h或过夜，或4℃, 48 h（抗原肽与HLA-A2:Ig需孵育过夜）**以上为针对高亲和力的目的肽段，用被动加载方法即可达到很好的效果。如果目的肽段与MHC亲和力很