NK细胞毒活性-LDH释放法.ppt

免疫学实验 ·*· NK细胞毒检测 ·*· 实验分组及材料 实验原理 检测方法 主要操作步骤 结果判定 主 要 内 容 ·*· 器材 75%酒精 若干 无菌纱网 1块/组 无菌平皿 1块/组 无菌吸头（大、中、小）3盒/room 无菌96孔培养板 1块/组 可调微量加样器 1套/组 细胞计数板 1套/组 显微镜 1台/组 EP管 若干 眼科剪、小镊子 1套/ 组 细胞培养箱 1台/room 酶标仪 1台 离心机 2个/room 超净台 1台/组 4mlEP管： 2个/组 动物、细胞及试剂 小鼠 1只/组(NS,OVA) YAC-1 1*105 * 2ml 培养液（1640) 无FCS 5ml/ 组 培养液(1640) 3%FCS 10ml/组 LDH底物 3ml/组 柠檬酸（终止液）1ml/组 分组： 每组4人 1只小鼠 实验分组及材料 ·*· NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。 YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。 原 理 ·*· 密度梯度离心 Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心 磁化细胞分离器分离法 NK细胞分离方法 ·*· 同位素释放法： 51Cr、3H-TdR、125I-UdR 　　 乳酸脱氢酶释放法 (本次实验采用) 常用的检测方法 ·*· G0 G1 S Na251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR New DNA Or Protein cpm 同位素释放法 ·*· 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。 同位素释放法 ·*· 乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的Ａ值，可测得杀伤细胞毒活性。 乳酸脱氢酶释放法-原理 ·*· 靶细胞 YAC-1 NK 杀伤 LDH 释放到细胞外 无色底物 LDH底物 还 原 有色物质 测OD570值 乳酸脱氢酶释放法 靶细胞 膜损伤 最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值 自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值 杀伤率( %)= Max- S自发 实验值-自发释放值 ×100 ·*· 操作流程 1W 无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640（无FBS) 细胞计数 【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝 加板(三复孔) (加法见附图) 调细胞浓度 1×107 /ml 5%CO2 37℃培养2小时 离心，取100ul上清移入新孔， 37℃孵育10min 加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min 30?l /孔 1mol/L柠檬酸 酶标仪测吸光度值：OD570nm 结果判定： 培养YAC－1细胞 ＋10%FBS　1640培养液 调细胞浓度 1×105/ml ·*· 单细胞悬液的制备 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000ul加样器将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用2ml 1640培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 1000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加