DNA条形码技术在中药材疑难品种鉴别中的应用研究.doc

项目基 本信息 项目名称 DNA条形码技术在中药材疑难品种鉴别中的应用研究 预计研究时间 12个月 课 题 摘 要 DNA条形码是指可代表某一物种的一段标准DNA序列，可作为各物种生物身份识别特征。中药材DNA条形码分子鉴定法包括单片段条形码及条形码片段组合。已有报道称ITS2序列更适合于中药饮片、粉末、标本、长期贮藏的中药材等DNA已部分降解的样品。本课题拟将DNA条形码技术应用于中药材检验。其中植物类药材DNA条形码选择以ITS2序列为主体，以psbA-trnH序列为辅助。动物类药材DNA条形码由CO1序列构成，ITS2为辅助序列。提取较为完整的DNA，然后利用通用引物扩增短的条形码序列来实现中药材的快速准确鉴定。DNA条形码技术具有快速、准确、自动、容易数字化等优点，可以满足目前我所对检验工作提出的“公正、准确、科学、高效”的要求。 关键词（用分号分开，最多5个） DNA条形码；中药材鉴别 基本信息 研究的目标和内容 研究目标：对检验工作中遇到的易混淆的中药材，参考文献，选择通用引物，建立DNA条形码鉴别平台，并应用于日常检验中； 研究内容：拟选择传统鉴别中的疑难品种铁皮石斛、林下山参等进行前期研究，建立平台，进而扩展到其他品种。 研究的必要性与可行性 一、研究的必要性 1、传统的四大鉴定方法可以确定部分中药的基原品种，但来自近缘物种的中药材和中药饮片与传统的鉴定方法相比较，DNA?条形码技术用短的、标准的DNA?片段作为物种标记进行鉴定，不受个体形态、大小等特征和完整性的影响，能直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据，可以实现对中药材原植物、饮片、粉末以及细胞、组织等材料来源的准确鉴定。传统鉴定方法需要鉴定人员具有较高的专业知识和长期的经验积累，实际鉴定工作纷繁复杂种类繁多的中药材鉴定难度大DNA条形码不仅是传统物种鉴定的强有力补充，更由于它采用数字化形式，使样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用有机体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统，对中药品种监管工作带来极大便利。我室已有开展分子实验的基本设备：包括：洁净操作台、凝胶成像分析系统、梯度PCR仪、电泳系统。 川贝母、蕲蛇检验工作：自2010年《中国药典》收载了川贝母、蕲蛇的PCR测定方法之后，申请人及其研究团队一直负责进行着DNA分子鉴定技术在药材鉴定方面的工作。 交流与学习：我室已有两名研究人员赴北京协和医科大学药用植物研究所DNA条形码课题组交流与学习。 DNA条形码技术（DNA Barcoding）近年来已成为国际上生物多样性研究的热点，正广泛应用于生物多样性调查、分子进化、生态、环境、食品安全等诸多领域：DNA条形码技术，特别是以ITS2为通用引物的植物DNA分子鉴别技术以COⅠ为通用引物的DNA分子鉴别技术较为成熟，数据库不断扩大，且有诸多文献报道可以参考。 A、基原考证、样品收集 通过文献查询、实地考察，进行基原考证； 收集样品： 拍摄生境照片，记录样品采集地GPS参数、采集时间，并以样品形态特征进行标本鉴定。 B、提取DNA，考察提取条件 对DNA OD260/OD280值、浓度、总量及条带清晰度进行测定和观察。 C、PCR扩增 筛选DNA条形码，包括线粒体基因：COⅠ，16S rRNA ，Cytb，12S rRNA，ND6等；核基因：18S rRNA，ITS等。筛选引物、优化反应条件。 D、PCR产物测序、序列分析 使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物。应用专业软件进行序列拼接，获得相应的DNA序列。对于种以上水平序列差异的分析运用基于距离的分析方法：邻接法、BLAST搜索、遗传距离分析；种以下水平序列差异分析运用基于特征的分析方法：DNA 序列中核苷酸的组成、替换与缺失分析。 E、方法学验证 影响因素考察：考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素，包括DNA提取(样品量、水浴温度和水浴时间)、PCR条件(变性时间、退火温度与时间及延伸时间)及产物纯化(考察不同纯化试剂盒)，保证实验方法的准确性。 精密度考察 ①重复性：至少用3批供试品，每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评价。实验结果判定应基本一致。 ②中间精密度：考察实验室内部条件改变(如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间)对测定结果的影响，至少应对同实验室不同操作人员的结果进行考察。 ③重现性：实验结果在3家以上实验室能够重现，相同样品在不同实验室获得DNA条形码序列应相同。 方法适用性考察：采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定，积累数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。基原物种对比验证：以分类学家确认的基原物种为对象，采用该方