SN_T 2625-2010病毒性脑病和视网膜病检疫规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2625-2010病毒性脑病和视网膜病检疫规范Quarantine protocol for viral encephalopathy and retinopathy2010-05-27发布2010-12-01实施中华人民共和国国路空询N发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T2625--2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）发布的《水生动物疫病诊断手册（ManualofDiagnosticTestsforAquaticAnimals）》（2006英文版）的第2.1.7章：病毒性脑病和视网膜病（CHAPTER2.1.7.VIRALENCEPHALOPATHYANDRETINOPATHY）的诊断方法，并增加了实时荧光RTPCR检测方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。本标准主要起草人：陈信忠、龚艳清、徐淑菲、孔繁德、谢明星、柯华生、王景明、周斌华。1 SN/T2625—2010病毒性脑病和视网膜病检疫规范1范围本规程规定了鱼类病毒性脑病和视网膜病（又称病毒性神经坏死病）的实验室检测方法。本规程适用于鱼类病毒性脑病和视网膜病病原的鉴定及其流行病学调查和监测。22规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T1193基因检验实验室技术要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。3. 1VERviral encephalopathy and retinopathy病毒性脑病和视网膜病。3.2VNNVviral nervous necrosis virus病毒性神经坏死病毒。3.3CPEcytopathic effect细胞病变作用3.4RT-PCRRreverse-transcriptionpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应。3.5FITC fluorescein isothiocyanate异硫氰酸荧光素。3.6Ct 值cycle threshold荧光信号达到设定的阈值所经历的扩增循环次数。4试剂和材料所有实验用试剂均为分析纯。TRIzol、Taq酶、逆转录酶、RNase抑制剂、dNTPs（含dATP、4.11 SN/T 2625-2010dUTP、dCTP、dGTP)等核酸提取试剂、RT-PCR及荧光RT-PCR所需试剂可选用专业试剂公司提供的商品化试剂及试剂盒。4.2VER阳性对照由国家指定机构提供。4.3SSN-1或E-11细胞。4.4兔抗-β野田村病毒血清由国家指定机构提供。4.5FITC标记的羊抗兔IgG抗体以及生物素标记的羊抗兔IgG抗体。RT-PCR引I物：VERR:5-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3，VERF:5-CGT-GTC4.6AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3”；荧光定量RT-PCR的引物：正向引物VERYF：5’-GGACCTCGTCGGGAAAGGAG-3”，反向弓物VERYR：5-GACACAGCACTGACACGTTGA-3”，探针5”-（FAM)CGTCACCTGGTCGGCTGATACTCCTGT-3TAMRA)Davidson氏固定液（见附录A第A.1章）4.74.8二甲肿酸钠缓冲液（见附录A第A.2章）4.9戊二醛固定液（见附录A第A.3章）胰蛋白酶-EDTA混合消化液（见附录A第A.4章4.104.11细胞培养液（见附录A第A.5章）。4.12PBS（见附录A第A.6章）。4.13PBST（见附录A第A.7章）4.14TBS（见附录A第A.8章）。4.15TBE电泳缓冲液（见附录A第A.9章）4.16Spurr树脂。4.17实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格用于RNA提取及RT-PCR实验的水应进行DEPC处理。5器材和设备5.1荧光定量PCR仪。5.2PCR扩增仪。5.3高速冷冻离心机。5.4电泳仪。5. 5凝胶成像分析系统或紫外检测仪5.6微量可调移液器。5.7荧光显微镜。5.8倒置显微镜。5.9组织切片机。5.10微量细胞培养板。5.11具有符合SN/T1193的实验室。6显微镜检查6.1光学显微镜检查6.1.1取样活体解剖取鱼类的眼、脑和脊索等神经组织。2 SN/T2625-20106.1.2固定迅速将组织切成厚度不超过3mm的组织块，用Davidson氏固定液固定2h以上。根据组织块大小，固定时间可适当调整，或放置过夜，期间按