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同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和应用.pdf

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第 37卷 第 4期 渔 业 科 学 进 展 Vo1-37.NO.4 2016 年 8 月 PROGRESS IN FISHERY SCIENCES Aug.,2016 DOI:10.11758/yykxjz.20150606001 http:/w/ww.yykxjz.cn/ 同步检测 7种鱼类病毒的扩增子拯救多重 PCR (Arm.PCR) 水 王胜强 ,3 耿伟光 史成银 ,2① 李 晋 粟子丹 (1.农业部海洋渔业可持续发展重点实验室 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071; 2.青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071; 3.上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306) 摘要 淋巴囊肿病~(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、 传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒V(HSV)和传染 性鲑鱼贫血症病毒0SAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这 7种病原的高通量、同步 检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物, 并对扩增体系中的Taq酶、Mg2+、dNTP、PrimerMix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基 因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm.PCR方法。优化后的Arm.PCR方法第一步PCR 体系为:Taq酶(2.5U/~d)1.0 l,IOxPCRBuffer(含20mmol/L的Mg)5Ixl,dNTP(各2.5mmol/L)5 l, lOxPrimerMix(各2~mol/L)9 1,模板 1pl,ddH2O补足至50 ,退火温度为56℃。研究结果显示,该 方法可以在 1支反应管内对上述 7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为 10 copies#d(RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、10copies/l~l(LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和 10copies/Ixl (大菱鲆红体病虹彩病毒,rRmV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA 不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测 7种鱼类病毒的Ann.PCR方法具有高通量、高灵敏度、高 准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。 关键词 鱼类病毒;多重检测;高通量;多重PCR 中图分类号 $943 文献标识码 A 文章编号 2095.9869(2016)04.012807 随着社会经济的快速发展,水产养殖业也呈现出 病毒 (Infectiouspancreaticnecrosisvires,IPNV)(Wallace 养殖规模和养殖技术的空前提高,尤其在集约化养殖 etal,2008)、病毒性出血败血症病毒(Viralhemorrhagic 和工厂化养殖方面发展迅速 。但在海水经济鱼类的养 septicemiavires,VHSV)(Isshikietal,2001)和传染性鲑 殖过程中,病毒性疾病 的暴发往往会给养殖业带来巨 鱼贫血症病毒(Infectioussalmonnaaemiavires。ISAV) 大的危害。淋巴囊肿病毒(Lymphocystisdiseasevirus, (Lyngstadetal,2012;Godoyetal,2013)是养殖鱼类主 LCDV)(徐洪涛等,2000)、肿大细胞病毒属虹彩病毒 要的病毒性病原,它们均能引起传染性、暴发性疾病, (Megalocytivirus,Mega)(Chaoetal,2004)、赤点石斑鱼神 同时伴随着高死亡率,给养殖企业造成严重的经济损 经坏
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