稻瘟病菌孢子的分离和保存方法.doc

稻瘟病菌孢子的分离和保存方法 　　摘要：介绍了稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]孢子的分离和保存方法，并加以比较和分析。结果表明，将发病组织进行保湿培养，产孢后用洗耳球将孢子吹到培养基上挑取单一菌落，采用滤纸片法保存，可以很好地分离和保存稻瘟病菌单孢。 　　关键词：稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； 单孢； 分离； 保存 　　中图分类号：S432.4+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6252-03 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.040 　　Abstract： The methods of isolation and preservation of single spore of rice blast fungus were introduced， which were taken into comparison and analysis. The results showed that the diseased tissues were cultured by moisture-retaining， then the spores produced were blown into the plate culture medium to pick a single colony with ear washing bulb and preservated by filter paper method， which could isolate and preservate the single spore of rice blast fungus commendably. 　　Key words： rice blast fungus[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]； single spore； isolation； preservation 　　由稻瘟病菌[Magnaporthe grisea（Hebert）Barr]引起的稻瘟病是世界上水稻三大病害之一，给水稻的产量和质量造成了严重的影响。长期的生产实践证明，选育和种植抗稻瘟病品种是防治稻瘟病最经济、有效和安全的措施，符合人类对绿色食物的要求[1]。选育抗稻瘟病品种需要在田间对待选材料苗期、分蘖盛期和孕穗初期进行人工接种鉴定，选择出抗病且大田表现较好的水稻材料，其中关键的一个环节就是获取足够量的接种体――稻瘟病菌分生孢子。这就需要从发病的水稻标样上分离得到不同稻瘟病菌株的单孢并加以保存。本研究介绍了稻瘟病菌孢子的一些分离和保存方法，并加以比较和分析，为育种工作者分离和保存稻瘟病菌孢子并进行接种鉴定提供参考。 　　1 稻瘟病菌孢子的分离方法 　　1.1 手工直接挑取孢子的单孢分离法 　　张君成[2]的单孢分离法是用手工直接挑取孢子，所需材料设备比较简单，但操作难度大，技巧性强。首先在酒精灯上将接种针针尖烧红，然后用镊子将针尖弯曲1 cm左右，制成所需要的接种针。用无菌刀片将清水琼脂（WA）平板切成2 cm×1 cm的琼脂块，挑取一块置于无菌的载玻片上，制成挑孢琼脂块。 　　在超净工作台上，取出穗颈瘟标样，用接种针的弯曲部分轻轻触碰标样黏附孢子，然后沿挑孢琼脂块的对角线轻轻划一下，将孢子转移到挑孢琼脂块表面。将含有孢子的琼脂块放到载物台上，寻找分散的单个孢子，并将其移至视野中央。用接种针轻轻靠碰视野中央的单个孢子，使孢子黏附到针尖上，然后轻轻抬起针头，移离显微镜。 　　左手取准备好的试管斜面培养基，右手将黏有孢子的接种针小心移入试管内，在培养基斜面上将针尖快速滑动1～4次，即可将孢子释放到培养基上，适温培养后长成单孢菌落。 　　手工直接挑取单孢的方法所需材料设备简单易得，试验过程在一般的场地即可进行，并且适用性好，可以分离不同大小和种类的孢子，但是这种方法操作难度比较大，技巧性强，对操作人员的要求很高，初学者一般很难掌握。 　　1.2 连续变倍体视显微镜单孢分离法 　　张书建等[3]在平板稀释法和震落法的基础上进行改良，总结出了一种较为简单、准确、快速的单孢分离法。首先对发病的组织进行保湿培养。取新采集的穗颈瘟标样，浸泡在体积分数75%乙醇中消毒30 s，然后用无菌水冲洗3次。在一次性培养皿中放入2层吸水纸或1张滤纸，加入少量无菌水，浸湿吸水纸或滤纸即可。然后把消过毒的穗颈瘟标样放在培养皿内，盖好后室温保湿2～3 d，直至标样表面出现深灰色的霉层。 　　用无菌的镊子夹起已长出霉层的发病组织，在清水琼脂（WA）平板的上方用力持续捏洗耳球，产生的气流就