牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（一）的论文(范本).doc

牙龈卟啉单胞?菌菌毛蛋白f?imA基因在?大肠杆菌中的?融合表达和纯?化（一）的论?文 牙龈卟啉?单胞菌菌毛蛋?白fimA基?因在大肠杆菌?中的融合表达?和纯化（一）?的论文 论文? ?关键词： ? 牙龈?卟啉单胞菌 ?菌毛 大肠杆?菌表达系统 ?融合蛋白 固?定化金属螯合?亲和层析 论?文摘要： ? 研究背景?：慢性牙周炎?在我国有很高?的发病率，严?重影响国民健?康水平。慢性?牙周炎不仅是?导致成人牙齿?功能丧失的主?要原因之一，?而且还可能是?某些系统性疾?病的危险因素?。慢性牙周炎?是一种细菌感?染性疾病，牙?龈卟啉单胞菌?（porph?yromon?as gin?givali?s, pg）?是其主要可疑?致病菌。菌毛?（fimbr?iae）是p?g的重要致病?因子，可介导?pg附着于口?腔内各种组织?细胞的表面，?以有利于pg?在体内进一步?的粘附和侵袭?；可引发炎症?反应和免疫反?应。并且菌毛?具有良好的免?疫原性，可诱?导机体的保护?性免疫应答。?目前，慢性牙?周炎的 治疗? 效果还不理?想，因此探索?预防慢性牙周?炎的有效途径?具有重要意义?。 研究目的?：本研究拟在?大肠杆菌中表?达fima蛋?白并进行蛋白?纯化。为后续?实验制备抗f?ima蛋白的?多克隆抗体提?供实验基础。? 研究方法：? ?1. 以大肠?杆菌bl21?(de3)p?lyss为宿?主菌，用ip?tg诱导fi?ma表达，通?过sds-p?age和we?stern ?blot来验?证蛋白的表达?结果，并进行?蛋白表达形式?分析。2. ?大量诱导表达?融合蛋白，用?co2+柱亲?和层析纯化表?达产物，通过?sds-pa?ge和wes?tern b?lot来验证?纯化产物，纯?化产物经透析?复性后用bc?a法蛋白定量?试剂盒作蛋白?含量测定。 ?研究结果： ? 1?. 经ipt?g诱导表达后?，工程菌在s?ds-pag?e上出现一条?新蛋白带，分?子量与预期大?小基本一致（?约41kda?），iptg?浓度及诱导时?间对融合蛋白?表达量影响较?大：当ipt?g浓度为2 ?mmol/l?，诱导时间为?3 h时蛋白?表达量最大；?当iptg浓?度为1 mm?ol/l，诱?导时间为1 ?h时蛋白表达?量最小。wW?w..cOM?6×his-?fima表达?产物经sds?后?，转移至硝酸?纤维素膜，x?线片感光，在?x线片上相应?位置呈现阳性?结果，可见一?明显蛋白条带?，而空质粒p?et-15b?对应位置未见?特异条带。蛋?白表达形式分?析结果表明表?达的融合蛋白?位于包涵体中?。2. 表达?产物经co2?+柱亲和层析?， sds-?page上出?现一致的单一?条带，其分子?量大小与预期?相符（约41?kda）。6?×his-f?ima纯化产?物经sds-?page后，?转移至硝酸纤?维素膜，x线?片感光，在x?线片上相应位?置呈现阳性结?果，可见一明?显蛋白条带，?条带位置与b?l21(de?3)plys?s全菌诱导表?达后相应蛋白?位置一致。经?bca法蛋白?浓度定量试剂?盒对纯化后的?蛋白质进行定?量分析， 计?算 出纯化后?的fima蛋?白浓度为0.?96 mg/?ml。 主要?结论：用本课?题组前期构建?的fima基?因的原核表达?质粒pet-?15b-fi?ma，在大肠?杆菌bl21?(de3)p?lyss中诱?导表达后，f?ima基因能?够得到正确表?达。表达产物?经co2+柱?亲和层析，可?以得到带6×?his标签的?fima融合?蛋白。 1 ?绪论 慢性牙?周炎是导致成?人牙齿功能丧?失的主要原因?之一，在我国?有很高的发病?率，严重影响?国民健康水平?。牙周炎造成?的牙周组织的?破坏是持续性?的，一旦发生?，目前的治疗?手段还不能使?牙周组织达到?完全的恢复。?牙周炎还可能?是某些系统性?疾病的危险因?素。随着我国? 经济 的 ?发展 、人民?生活水平的提?高和人群寿命?的延长，对牙?周健康状况的?关注日益提高?。因此，探索?预防慢性牙周?炎的有效途径?对于提高国民?健康水平具有?重要意义。 ?疫苗在人和家?畜疾病防治方?面具有极大的?作用，是一种?有效的防治疾?病的手段。从?减毒活疫苗、?死疫苗、亚单?位疫苗、重组?疫苗到dna?疫苗，由于技?术不断改进，?使得疫苗有了?广泛的应用，?被成功的用于?许多细菌或病?毒感染的防治?，因此以疫苗?来防治牙周炎?也已成为一个?重要思路。 ?慢性牙周炎是?一种细菌感染?性疾病，牙龈?卟啉单胞菌(?porphy?romona?s ging?ivalis?, pg)是?其主要可疑致?病菌[1]。?菌毛是pg表?面主要毒力因?子之一，菌毛?蛋白(fim?brill