第七章 DNA复制幻灯片.ppt

半保留复制的实验结果 15N DNA显示为一条重密度带位于离心管的管底。 15N DNA和14N -DNA的杂交分子为中密度带。 第二代有中密度带及低密度带两个区带，这表明它们分别为15N 14N －DNA和14N -DNA。 在14N培养基中培养代数的增加，低密度带增强，而中密度带逐渐减弱。 半保留复制进一步的实验证椐 15N DNA、14N DNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。 结果变性前的杂交分子为一条中密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带(15N DNA)及低密度带(14N DNA)。 （二）DNA的半不连续复制 DNA双螺旋走向是5′→3′, 3′→5′方向，DNA聚合酶只能催化DNA从5′→3′的方向合成。在以3′→5′方向的母链为模板时，复制合成出一条5′→3′方向的前导链(leading strand)，前进方向与复制叉打开方向是一致的，因此前导链的合成是连续进行的。 以5′→3′为模板时，先合成多条5′→3′方向的短链，这一系列的片段叫做冈崎片段，然后再把它们连接成完整的后随链(lagging strand) 。 前导链的合成是连续的，后随链的合成是不连续的，所以DNA的复制是半不连续复制。 半不连续复制: 冈崎片段Okazaki fragment 二、DNA复制过程的三个阶段 DNA复制的起始阶段，包括起始点，复制方向以及引发体的形成。 DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段。 DNA复制的终止阶段。 （一）DNA复制的起始阶段 复制是从DNA分子上的特定部位开始的，复制起始点(originof replication)常用ori或o表示， DNA中发生一次复制的单位称为复制子或复制单元(replicon)。 在原核细胞中只有一个复制起始点，一个复制子。 在真核生物中复制是从许多起始点同时开始的，即有多个复制子。 部分生物复制子的比较 1、DNA复制起始点的结构特性 有些生物复制起始点Ori是富含A·T的区段。这些特殊的结构对于在DNA复制起始过程中参与的酶和许多蛋白质分子的识别和结合都是必须的。 3、DNA复制的起始 DNA双螺旋的解旋 复制的引发 DNA双螺旋的解旋 在拓扑异构酶I的作用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作用，在复制起点处解开双链。解链过程中必需有SSB蛋白来稳定已解开的单链，以保证该局部结构不会恢复成双链。 复制的引发 所有的DNA聚合酶都需要3’羟基端起始DNA合成。 3’羟基端被称为引物。 （二）DNA链的延长 DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下，将四种dNTP聚合成DNA的过程。 需要许多种酶和蛋白质参与。 1、DNA聚合酶 1957年，Arthur kornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶Ⅰ简写DNA polⅠ，后来又相继发现了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ等。 DNA聚合酶III生物活性形式为二聚体。它的聚合活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。它能在引物的3’—OH上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导聚合酶。 真核生物由不同的DNA聚合酶分别负责起始和延伸 细胞核DNA复制需要α、 δ和ε。 α起始新链合成。 δ延伸先导链。 ε可能与后随链合成有关，也可能具有其他功能。 DNA聚合酶的性质 需要DNA模板 需要RNA做为引物 催化dNTP加到引物的3′-OH末端 DNA聚合酶都属于多功能酶，它们在DNA复制和修复过程的不同阶段发挥作用。　 2、与超螺旋松驰有关的酶 拓扑异构酶(topoisomerase)改变DNA拓扑性质的酶，松驰超螺旋，有利于复制叉的前进合成。 拓扑异构酶有Ⅰ型和Ⅱ型，原核、真核中均有。 （三）DNA复制的终止阶段 大肠杆菌DNA具有复制终止位点，此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做Tus，通过阻止解链酶的解链活性而终止复制。 链的终止需要Tus蛋白参与。当复制叉前移，遇到20bp重复性终止子序列（Ter）时，Ter-Tus复合物能阻挡复制叉的继续前移，等到相反方向的复制叉到达后在DNA拓扑异构酶IV的作用下使复制叉解体，释放子链DNA。 三、真核与原核生物DNA复制的特点 真核生物是多点复制，原核生物是单点复制。 真核生物在完成全部复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始；原核生物起始点上可连续开始新的DNA复制。 真核生物线性DNA末端具有端粒结构。 端粒的结构 是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体，由多个串联在一起的短寡核苷酸5-8bp序列组成。 5 ’-（TxGy）n；3’-(AxCy)n； 其中x，y是碱基数，一般在1-4范围内。n