薏苡仁多糖对实验性糖尿病血管并发症大鼠主动脉inosmrna表达调控的影响.docx

薏苡仁多糖对实验性糖尿病血管并发症大鼠主动脉inosmrna表达调控的影响 糖尿病引起的血管病变主要与糖代谢障碍、糖基化和脂质代谢功能障碍密切相关。目前大多数学者认为糖尿病血管病变与内皮功能受损密切相关,一氧化氮(NO)在其中起十分重要的作用。NO是由NO合酶(NO synthase,NOS)催化L-精氨酸(L-Arginine,L-Arg)合成。NOS分结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)两种,NOS的活性依赖于Ca2+和钙调素(CaM)介导,它主要存在于内皮细胞和神经元中,合成的NO作为信使分子起生理作用,而NOS的活性则不依赖Ca2+和CaM介导,它主要存在于巨噬细胞和肝细胞中,合成过量的NO起细胞抑制和细胞毒作用。有研究表明,链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病模型大鼠血管内皮细胞iNOS 表达上调。我们观察薏苡仁多糖对糖尿病血管并发症大鼠NO及主动脉iNOS mRNA表达的影响,现报告如下。 1 材料和方法 1.1 大鼠颗粒料的制备 健康成年Wistar大鼠[清洁级,许可证号:SCXK-(军) 2002-008],200只,12周龄,雌性,体质量(200±20) g,高热量饲料由大鼠常规饲料120 kg、白糖15 kg、猪油20 kg、鸡蛋10 kg、胆固醇1.7 kg,充分搅拌均匀后,用脱粒机制成大鼠颗粒料,控温烘干。动物及饲料均由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。 1.2 分析纯试剂 RNA提取试剂盒Tripure(Boehringer Mannheim公司),RNase inhibitor(Promega公司),M-MLV及5×buffer(Promega公司),Agarose(Sigma公司),Pfu DNA Dolymerase及10×buffer(上海生物工程技术服务有限公司),DEPC(焦碳酸二乙酯)(Roche公司),小分子量DNA marker(上海复华公司),其他试剂均为分析纯。 高速低温离心机(Heraeus公司),PCR仪(Sigma公司),凝胶成像系统(Bio-Rad公司),电泳装置(Bio-Rad公司),Saitroius 电子天平(Saitroius公司)。 1.3 方法 1.3.1 高热量饲料的制备 大鼠适应性喂养3 d后禁食12 h,取10只作为正常组,10只作为高热量饲料组。余下的按35 mg/kg剂量腹腔注射STZ(临用前用pH 7.4,0.1 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠溶液配制成2%的溶液),正常组和高热量饲料组腹腔注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠溶液,2 d后,挑选血糖值在11.1～20 mmol/L的大鼠按血糖值、体质量,分为模型组、氨基胍组、阿卡波糖组、薏苡仁多糖组Ⅰ～Ⅵ,每组10只,在给予高热量饲料的同时给予药物,正常组给予普通饲料和蒸馏水。 1.3.2 给药方法 腹腔注射按0.2 ml/100 g体质量配制;灌胃给药按0.5 ml/100 g体质量配制(表1),每天1次,给药时间为6个月。 1.3.3 血管腔的制备 6个月后,将禁食12 h大鼠经速眠新肌注麻醉,常规消毒,打开胸腔心脏取血后,立即取主动脉部分,剪开血管腔,用无菌生理盐水漂洗血迹后,投入液氮中,冻存备用。 1.3.4 rt-pcr扩增 RT-PCR引物根据文献报道,由上海生物工程技术服务有限公司合成。 用于iNOS、RT-PCR的引物:iNOS上游引物P1:5′-CTACCTACCTGGGGAACACCTGGGG-3′(25 bp);iNOS下游引物P2:5′-GGAGGAGCCGATGGAGTAGTAGCGG-3′(25 bp),RT-PCR扩增产物长度418 bp。 RT-PCR内对照β-actin引物:上游引物P3:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACAC-3′(21 bp);下游引物P4:5′-TAAAGCCATGCCAAATGTCTC -3′(21 bp)。β-actin PCR扩增产物长度331 bp。 1.3.5 rna的测定方法 根据RNA提取试剂盒Tripure操作指南一步法提取样品总RNA。取100 mg大鼠肾脏放在经高温高压消毒的研钵中,加入液氮研碎后,转入Ep管中,加入1 ml Tripure,振荡30 min,再加氯仿(0.2 ml/ml Tripure)混匀,4 ℃ 12 000×g离心,取上清加等体积异丙醇混匀,4 ℃ 12 000×g离心,沉淀以75%乙醇洗涤,50 μl无菌TE重溶,紫外分光光度仪测定D(260)/D(280)比值(检测RNA样本的纯度),根据公式计算样本浓度: RNA(mg/ml)=D(260)×40×稀释倍数RNA溶液总体积(ml)RΝA(mg/ml)=D(260)×40×稀释倍数RΝA溶液总体积(ml) 加样前使各样品中总RN