ELISA的基本原理及质量控制.ppt

ELISA的基本原理及质量控制The fundamental principle and quality control of ELISA;ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay ——酶联免疫吸附实验）是20世纪60年代发展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。 ELISA的特点： 敏感度和特异度较高，重复性好。 试剂比较稳定，易于保存。 操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。 易于标准化和对检测对象进行定量。 可以自动化。 ;ELISA的基本原理;将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。 　 ;抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。;间接法ELISA;1.加样;使用RF吸附剂;麻疹IgG;RF吸附剂的组成;;捕获法ELISA;1.加样;ELISA试剂的组成;酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。 辣根过氧化物酶（HorseRadish Peroxidase，简称HRP）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase ，简称AP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。;底物：不同种类的酶要求使用不同的底物。 HRP——邻苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD） 、四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS 『2,2‘-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)』，OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。 AP——对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。 ;洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20（聚山梨酯 ）。 洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。 ;标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。 RF吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间接ELISA方法需要使用RF吸附剂去除类风湿因子的干扰作用。;ELISA的质量控制及注意事项;ELISA质量控制的目的;ELISA准确度的影响因素—患病率;患病率和阳性预测值(PPV)的关系;解决方法;ELISA准确度的影响因素—实验过程;ELISA实验过程中涉及的质量控制—仪器; ELISA的标本最为常见的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。 要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。;血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。 冻存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。 ;标准操作规程（SOP） 实验纪录 日期 操作人员 试剂批号 试剂有效期 试剂准备，使用前在室温平衡20min以上，以便在温育时很快达到反应要求温度，避免弱阳性标本产生假阴性结果。 水浴;试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内 ELISA板的空白对照OD值在控制范围内 实验室内部质控血清(In- House Control, IHC) 每次试验都要包括一个实验室质控血清。 可以监测标本处理过程，而试剂质控只能监测之后的过程。 确保每次试验操作的正