猪精子顶体蛋白活化调控的研究.docx

猪精子顶体蛋白活化调控的研究 猪精尖醇的分子质量为32ku，可与顶体素原和顶体素受体结合。形成的顶素可以诱导储存反应，并被称为精炼蛋白32（spermproone32，sp32）。sp32有14个磷酸处理点，其中三个是谷氨酸磷酸化点。即sp32是精子蛋白(Sperm protein,sp)中特异性地结合前顶体蛋白(Proacrosin)并精细性的调控获能及受精的一类蛋白。 获能是受精的一个重要前提,精子蛋白在经历了一系列生理生化的改变和修饰后才具备跟卵子受精的能力,包括前顶体蛋白糖基化,精子脂质体改变和cAMP及精子表面负电荷的上调等。尽管获能的相关分子机制还不完全清楚,但是精子蛋白以AMP依赖的酪氨酸酸化途径发生磷酸化研究已颇多。有研究发现精子蛋白酪氨酸磷酸化过程可能受cAMP及Ca2+调控,同时重碳酸盐、ROS及蛋白激酶亦为动物精子获能的关键因子。S.Tardif等通过体外试验,将猪精子分别进行获能培养(即用获能介质与非获能介质培养)与离子电渗法诱导顶体反应试验,然后分别提取精子蛋白,经SDS电泳后用抗酪氨酸磷酸化抗体筛选,结果发现经过获能介质培养和离子电渗法诱导顶体反应的精子,均可在32 ku处出现一蛋白条带,而非获能介质培养的精子无此条带,他们将该蛋白称为P32,并推测P32可能参与获能。最近J.L.Bailey等利用蛋白质组学方法研究P32蛋白酪氨酸磷酸化,并证实P32与获能相关。与此同时,C.Dubé研究小组将体外制备的猪获能精子与非获能精子作对照,提取精子蛋白,经SDS电泳后分别用抗酪氨酸磷酸化抗体与抗sp32抗体检测,结果发现sp32与P32在电泳图上有条带的重叠迹象,再将P32进行蛋白质质谱(MS/MS)分析,通过氨基酸序列查询证实两种蛋白的序列完全一致,即P32为sp32经过酪氨酸磷酸化修饰的蛋白,这种变化伴随着猪精子的获能过程。另外sp32与精子顶体蛋白的成熟有非常重要的关系,所以sp32既是一种与精子获能相关的酪氨酸磷酸化蛋白,也是一种前顶体结合蛋白。但是sp32作为一种促进前顶体蛋白成熟的结合蛋白,其具体机制尚不清楚。 本研究通过对不同处理的猪精液进行顶体膜蛋白免疫印迹,从分子层面找到sp32表达程度及酪氨酸磷酸化程度对猪精子受精过程调控的微量关系,进而对研究猪精液的长期保存损伤机制提供一定的参考。 1 材料和方法 1.1 保温杯密封 试验所需猪精液均采自延吉市韩吉牧业有限公司的健康成年长白公猪。用保温杯密封避光并且在2 h内带回实验室,运输过程中将其温度保持在(24±2) ℃,用于试验的精液必须符合以下条件才可用于试验:①颜色为乳白色;②活率80%;③顶体完整性75%。 1.2 siga公司 D-C6H12O6、NaCl、KCl、NaHCO3、EDTA、柠檬酸二钠、Na2HPO4、BSA、MgCl2、KH2PO4、CaCl2、Tris和咖啡因等均购自Sigma公司。预染蛋白质相对分子质量标准(Page Ruler Prestained Protein Ladder SM0671)、PVDF膜、免疫印迹一抗(Rabbit Anti- Porcine sp32 antibody)、二抗(Goat Anti- Rabbit IgG(H+L) HRP)、一抗(Mouse anti-Phosphotyrosine)和二抗(Goat Anti-Mouse IgG(H+L) HRP)均购于北京华夏远洋生物科技有限公司。 1.3 试验设备 电子天平、台式高速低温离心机、冰箱、倒置显微镜、培养箱、超净工作台、垂直电泳槽、转移电泳仪、紫外分光光度计和荧光显微镜。 1.4 稀释液、提取液和培养基 常温保存液(BTS):D-C6H12O636.9 g,NaCl 1.191 g,KCl 0.402 g,NaHCO31.260 g,EDTA 1.247 g,硫酸卡那霉素50 mg,过0.22 μm微孔滤膜消毒,4℃封存待用。PBS:NaCl 8.00 g,KCl 0.20 g,Na2HPO4·7H2O 1.56 g,KH2PO40.24 g,青霉素6.00 mg,链霉素5.00 mg,超纯水定容至1 000 mL,过0.22 μm微孔滤膜消毒,4 ℃封存待用。冷冻稀释液基础液:D-C6H12O63 g,乳糖 4 g,超纯水定容至100 mL。冷冻稀释液:取冷冻稀释液基础液78 mL,煮沸后加22 mL新鲜卵黄,青霉素和链霉素各10 IU,甘油5 mL。现用现配。获能液:NaCl 3.31 g,KCl 0.112 g, CaCl20.473 9 g,Tris 1.212 g,D-C6H12O60.991 g,丙酮酸钠 0.275 g,咖啡因 0.194 g,BSA 0.5 g,庆大霉素 1.0 mg,超纯水定容至500 mL,