EP2.6.12非无菌药品微生物检验-微生物总数试验.doc

2.6.12 非无菌产品的微生物检查-微生物计数试验 （B.HARMONISED METHOD欧日美三方协调方法） 1 介绍 本试验适用于可以在有氧环境下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数。 本试验方法主要是用于一种物质或者制剂的微生物检测，以判断它的微生物质量是否符合已建立的质量标准。如本方法用于上述目的的话，需要按下面的描述进行操作，包括取样量和结果判断。 本方法不适用于以活微生物为活性成分的产品。 如果经证明，其他的微生物检查方法（包括自动化方法）和药典方法相当，也可以使用。 2 一般要求 在能够防止外来微生物污染的环境条件下进行检测。 所采取的防微生物污染措施必须对待测产品中已有的微生物无影响。 如果待测产品具有抑菌活性，则应该尽可能地将抑菌活性成分除去或者中和。如果使用灭活剂，则必须证明该灭活剂的功效及其对微生物不存在毒性。 如果样品制备使用了表面物质，应证明其对微生物没有毒性以及其与使用的灭火剂的兼容性。 3 计数方法 按照规定使用平皿法或薄膜过滤法。最大可能数法(MPN)是准确度最低的方法，但是对于微生物负荷量很低的产品确是最适合的方法。 方法的选择取决于产品的性质和规定的微生物限度等因素。所选用的方法必须能够测定足够的样品量以判断产品的微生物质量是否与质量标准相符合。同时 必须证明所选用方法的适用性。 4培养基促生长试验，计数方法适用性和阴性对照 4.1 总则 必须证明所选用的方法具有能够检测待测物质中微生物的能力。 如果试验条件或者产品发生了变化并可能影响到检测结果，则方法的适用性需要确认。 4.2 试验菌株的制备 使用稳定的标准菌悬液或者按照下述方法进行制备。应该采用种批培养维护技术（种源批次系统）以保证用于接种的活微生物的传代次数不超过五代。按照表2.6.12-1所示培养每一种细菌和真菌菌株。 使用pH 7.0 氯化钠蛋白胨缓冲液或者pH 7.2磷酸盐缓冲液配制试验用悬液；对于制备黑曲霉孢子悬液，可在缓冲液中加入0.05％聚山梨醇酯80。悬液在配制好后的两个小时内使用，如果储存于2-8℃，可以在24小时内使用。对于黑曲霉或者枯草芽胞杆菌营养细胞的制备和稀释得到新鲜的悬液，还可以用制备好的稳定孢子悬液来替代并用一定体积量的该孢子悬液进行试验接种。稳定的孢子悬液可以在2-8℃储存一段时间，但该储存时间必须是经过验证的。 4.3 阴性对照 为了确定实验条件对检测结果无影响，要用稀释剂代替供试液进行阴性对照试验。应无菌生长。按5项下要求进行样品检测时也应进行阴性对照。对于不符合要求的阴性对照结果应进行调查。 4.4 培养基促生长试验 应对每一批购买的成品培养基，每一批使用脱水培养基制备的培养基或者按照指定成分配制的培养基进行培养基促生长试验。 按照表2.6.12-1所示，接种少量的菌种（不多于100 CFU）于大豆酪蛋白胰酶消化肉汤和大豆酪蛋白胰酶消化琼脂琼脂得到的菌落数与相差应不超过2倍。菌株 培养基促生长试验 计数方法适用性 需氧微生物总数 霉菌和酵母菌总数 需氧微生物总数 霉菌和酵母菌总数 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, NBRC 13276 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂30-35℃ 18–24 小时 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3 天 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂/ MPN大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3 天 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa） ATCC 9027, NCIMB 8626, CIP 82.118, or NBRC 13275 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂30-35℃ 18–24 小时 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂/ MPN大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） ATCC 6633, NCIMB 8054, CIP 52.62, or NBRC 3134 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂30-35℃ 18–24小时 大豆酪蛋白胰酶消化肉汤和大豆酪蛋白胰酶消化琼脂≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂/ MPN大豆酪蛋白胰酶消化肉汤培养基 ≤100 CFU 30-35℃ ≤ 3天 白色念珠菌（Candida albicans） ATCC 10231, NCPF 3179, IP 48.72, or NBRC 1594 沙氏葡萄糖琼脂 20-25℃ 2–3天 大豆酪蛋白胰酶消化琼脂≤100 CFU 30-35℃ ≤ 5天 沙氏葡萄糖琼脂≤100 C