医学硕士研究生开题_报告范文.ppt

Company Logo 细胞凋亡原位检测的步骤： 采用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 1.石蜡切片常规脱蜡至水。 2.新鲜配制3%H2O2，室温处理15min。0.01M PBS液洗涤5min×3次。 * Company Logo 3.切片上滴加消化液（10mM Tris-Hcl 995ul加入1mg/ml Proteinase K 新鲜稀释至 5ug/ml）,37℃消化20min，0.01M PBS洗5min×3次。 4.新鲜配制通透液，4℃孵育20min或室温孵育8min。0.01M PBS洗5min×3次。 * Company Logo 通透液：取20 X SSC 20ul，TritionX-100 4ul（45℃-50℃预热）， 加单蒸水3.98ml，定容至100ml，充分均匀。 5.标记 甩去切片上多余液体，标本片擦干组织及周边水分，按每张切片滴加1液和 2液（1：9，混合均匀）配成TUNEL反应混和液（冰上操作）。 * Company Logo 阴性对照组只加入试剂2液，而不加1液。标本上覆盖塑料盖片，置样品于湿盒中，37℃标记1h，后4℃过夜。（20h以上）。0.01M PBS洗5min×3次。 6.滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温中30min，甩掉封闭液，不洗。 * Company Logo 7.转化剂—POD 50μl/片滴加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃孵育40min. 0.01M PBS洗5min×3次。 8.DAB显色，室温5-10min。单蒸水中止显色，流水冲洗10min。 9. 脱水，透明，封片。 * Company Logo 五 预期目标 1.检测不同发育时期的人胚胎脊髓中Nestin、NeuN、GFAP的表达及变化； 2.检测不同发育时期的人胚胎脊髓中细胞凋亡的情况； 3.探讨脊髓内神经元、神经干细胞、星形胶质细胞与细胞凋亡高峰出现的时间点有何相关性。 * Company Logo 六 已具备的条件 1. 本研究所下属三个实验室：组织化学实验室、细胞室和分子生物学实验室，可开展从形态至分子生物学技术的相关研究。 2. 导师李力燕教授和王廷华教授多年来从事神经科学的研究，尤其在脊髓发育的研究方面积累了丰富的经验，可提供宝贵的理论和实践指导。 * Company Logo 七 前期工作基础（可行性） 1. 本研究所具有专门的分子室、细胞室、免疫组化室，且各项技术都很成熟； 2. 已完成了神经营养因子家族与受体（包括NGF、BDNF、NT-3、NT-4、TrkA、TrkB、TrkC）在人胚胎脊髓中的免疫组化染色； 3. 掌握了免疫组织化学、原位杂交、H-E染色的实验技术。 * Company Logo 八 研究工作的主要阶段、进度和完成时间 1. 实验所需标本已制作完成 2. 2007.11－2008.1开始做预实验及正式实验 3. 2008.1－2008. 4 观察结果，图像分析统计，撰写论文 * Company Logo 九 经费预算 1. nestin、NeuN、GFAP三个抗体价格 Anti-NeuN：3437.50元（chemicon公司） Anti-nestin：3000元（chemicon公司） Anti-GFAP：3737.50元（Upstate公司） * Company Logo 2. 免疫组化试剂盒 第二代通用型二步法检测系统（北京中杉公司，PV-9000） 320.00元/3.0ml 3. 细胞凋亡原位检测试剂盒（TUNEL） Roche公司 4600元 4. 封闭用正常羊血清（原液）（北京中杉公 司，ZLI－9020）45元/10ml * Company Logo 5. 其他常规试剂约200元。 十 实验风险及前景分析 1. 由于实验对象是人胚胎标本，无法及时灌注固定，故有可能导致标本固定不及时不充分，从而使组织结构不完整，损失一部分抗原等； * Company Logo 2. 实验结果与预期不符 这就要求我们从标本固定取材开始直至后续的免疫组化染色和原位凋亡细胞的检测都严格操作，不忽视每一个环节、每一个步骤。试剂准备充分，实验设计合理，实验操作熟练、准确，努力将实验风险控制到最小程度。 * Company Logo 参考文献 [1] Gage F H. Mammalian neural stem cells [J]. Science, 2000, 287: 1433-1438. [2] 马以骝，杨志敏，王秦秦 等。大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究。立体定向和功能性神经外科杂志，2001，14（2）：63－69. [3] Cataudella T, Conti L,