不同胚胎期鸡肌肉组织发育研究方案.doc

不同胚胎期鸡肌肉组织发育研究方案 1. 项目背景及目的： 背景：近年来，已经有文献报道表观遗传调控，如DNA甲基化，组蛋白修饰和小RNA调控都对肌肉的发育具有重要的作用，其中一条重要的途径是通过表观遗传调控肌肉形成相关基因的表达[1]。因此，同时对肌肉组织的转录组和基因组甲基化进行分析（包括关联分析），是研究肌肉发育调控机理的一种高效，实用的方法。 数据：肉鸡和蛋鸡在四个不同胚胎发育时期，肌肉组织的全转录组分析+全基因组甲基化分析。两个品种的鸡（肉鸡、蛋鸡）在4个胚胎发育时期的样品，每组设置了三个生物学重复，2*4*3=24个样品。共24个全转录组测序+24个smallRNA测序+24个全基因组甲基化测序。 2. 分析期望： 不同胚胎发育期中，肌肉组织在转录组上的调控变化。 在相同胚胎发育期中，两不同品种的鸡，在转录组水平上调控的差异。 不同胚胎发育期中，肌肉组织在基因组甲基化层面上的调控变化。 在相同胚胎发育期中，两不同品种的鸡，基因组甲基化层面上的调控的差异。 探究鸡肌肉发育的调控机理。 3. 标准分析 全转录组： mRNA部分： 1. 数据过滤质控及统计 （fastqc） 2. 与参考序列比对及统计、评估；(Tophat) 3. 基因和转录本表达定量分析； (cuffinks+RSEM) 4. 基因差异表达分析； (RSEM/Ebseq,edgeR) 5. 差异基因的功能富集分析；(GO/KEGG) 6. 差异基因层次聚类分析； （通过基因表达量，Eucledian distance matrix，热图） 7. 差异基因蛋白互作网络分析；（STRING database） 8. 可变剪接分析 (rMATS) 9. 新转录本预测； (Trinity) LncRNA部分： lncRNA是细胞中一类转录本长度为150-200 nt的非编码RNA分子，本身并不编码蛋白或很少有编码蛋白质功能。近年的研究表明，lncRNA可参与X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程。 lncRNA识别分析： 1）从Cufflinks重建的转录组中提取外显子总长大于160nt的转录本； 2）对提取转录本序列进行物种间的保守性分析（PhyloSCF）； 3）对过滤的转录本进行同源性分析（blastx）； 4）采用CDS区域重叠和FPKM表达量进一步过滤； 5）将lncRNA划分为5种类型：反义的、包含内含子内部、完全与内含子重叠的、部分与内含子重叠的及基因之间的lncRNA。分析只局限于含有2个或2个以上外显子的的转录本，这是由于只含1个外显子的转录本很可能是片段拼接错误或者DNA污染导致等。这样处理可能会漏掉极少数潜在的lncRNA，但会最大程度地降低lncRNA的假阳性。 miRNA部分： microRNA(miRNA)是一种大小约21—23t的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70—90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。microRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达（最新发现microRNA也能在转录水平调控基因表达）。microRNA在物种进化中相当保守，在动物、植物和真菌等中发现的microRNA表达均有严格的组织特异性和时序性。microRNA在细胞生长和发育过程中起多种作用，包括调控发育、分化、凋亡和增殖等。 .数据过滤质控及统计； 2.小RNA长度分布统计；? 3.样品间的公共序列和特异序列的分析；? 4.Small RNA 在选定的参考基因组上的分布； 5.Small RNA 与重复序列的比对信息；? 6.Small RNA 与 exon/intron 的比对信息；? 7.Small RNA 与 miRBase 中指定范围的已知的 miRNA 的比对； 8.已知miRNA的表达谱构建。直接使用原始read值衡量特定microRNA的表达是不合适的。因此，我们将对microRNA的表达量进行标准化，将原始的reads数值转化为TPM（在每兆可与miRBase数据库中的pre-microRNA匹配的reads中，特定microRNA所占的reads数目）。根据标准化后的microRNA表达值（TPM），计算每个microRNA在不同的样本间的表达变化（fold change）,并通过ttest（或者相关R语言包如DEseq等）计算样本间microRNA表达量变化的统计学显著性。对表达变化倍数在2倍以上，p值小于0.01的microRNA被挑选出来，并定义为显著性差异表达的microRNA。针对多重比较，p值被校正为FDR。根据倍数