转录组学研究进展.doc

转录组研究前沿随着转录组学，蛋白组学，代谢组学等组学的不断涌现，生物学研究已经跨入后基因组时代，转录组学作为一个率先发展起来的技术开始在生物学前沿研究中得到了广泛的应用。广义转录组（Transcriptome）系指从一种细胞或者组织的基因组所转录出来的RNA的总和，包括编码蛋白质的mRNA和各种非编码RNA（rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA,microRNA 和其他非编码RNA等）。狭义转录组系指所有参与翻译蛋白质的mRNA 总和。转录组研究历史：自从上世纪90 年代中期以来，随着微阵列技术被用于大规模的基因表达水平研究，转录组学作为一门新技术开始在生物学前沿研究中展露头脚并逐渐成为生命科学研究的热点。原因如下：1)蛋白质组研究需要更多的转录组研究的信息：因为单一的蛋白质组数据不足以清楚地鉴定基因的功能，因此蛋白质组的数据需要转录组的研究结果加以印证。2)非编码RNA研究的不断发展，使得转录组研究的范围不断扩大和深化。 3) 随着新一代高通量测序技术运用到转录组研究之中，转录组研究中提供的数据量呈现爆炸式的扩增，极大拓宽了转录组研究解决科学问题的范围。目前进行转录组研究的技术主要包括如下三种：1）基于杂交技术的微阵列技术；2）基于Sanger测序法的SAGE (serial analysis of gene expression)和MPSS(massively parallel signature sequencing)；3）基于新一代高通量测序技术的转录组测序。各种转录组研究技术的特点如下：基于杂交技术的DNA芯片技术只适用于检测已知序列，却无法捕获新的mRNA。细胞中mRNA的表达丰度不尽相同，通常细胞中约有不到100种的高丰度mRNA，其总量占总mRNA一半左右，另一半mRNA由种类繁多的低丰度mRNA组成。因此由于杂交技术灵敏度有限，对于低丰度的mRNA，微阵列技术难以检测，也无法捕获到目的基因mRNA表达水平的微小变化。SAGE是以Sanger测序为基础用来分析基因群体表达状态的一项技术。SAGE 技术首先是提取实验样品中RNA并反转录成cDNA，随后用锚定酶(Anchoring enzyme)切割双链cDNA，接着将切割的cDNA 片段与不同的接头连接，通过标签酶酶切处理并获得得到SAGE 标签，然后PCR 扩增连接SAGE 标签形成的标签二聚体，最后通过锚定酶切除接头序列，以形成标签二聚体的多聚体并对其测序（关于SAGE方法细致的介绍请参考网站）。SAGE可以在组织和细胞中定量分析相关基因表达水平。在差异表达谱的研究中，SAGE可以获得完整的转录组学图谱以及发现新的基因并鉴定其功能、作用机制和通路等。MPSS是SAGE的改进版，MPSS 技术首先是提取实验样品RNA并反转录为cDNA，接着将获得的cDNA克隆至具有各种adaptor 的载体库中，并PCR 扩增克隆至载体库中 的不同cDNA 片段，然后在T4 DNA 聚合酶和dGTP 的作用下将PCR产物转换为单链文库，最后通过杂交将其结合在带有Anti-adaptor 的微载体上进行测序。MPSS 技术对于功能基因组研究非常有效，能在短时间内捕获细胞或组织内全部基因的表达特征。MPSS技术对于鉴定致病基因并揭示该基因在疾病中的作用机制等发挥了重要作用。自从2005年上市以来，第二代测序技术对基因组学的研究产生了巨大的影响并被广泛运用到了基因组测序工作之中。转录组测序也被称为全转录组鸟枪法测序（Whole Transcriptome Shotgun Sequencing， WTSS），以下简称RNA-seq。众所周知，真核生物的基因由三类RNA聚合酶转录：RNA聚合酶I和III负责其种类稀少，功能重要的看家非编码RNA基因的转录，包括rRNA，tRNA，snoRNA，snRNA等；而RNA 聚合酶II负责蛋白质编码基因和调控非编码RNA的转录，其转录产在加工过程中均会加上3端多聚腺苷尾。RNA-seq是对用多聚胸腺嘧啶进行亲和纯化的RNA聚合酶II转录产生的成熟mRNA和ncRNA进行高通量测序。所获得的海量数据经过专业的生物信息学分析，既可以还原出一种细胞内基因表达的种种特征。如果对不同种类的细胞进行并行的RNA-seq及生物信息学分析，即可以获得多种基因表达调控的重要信息。第二代高通量测序技术赋予了RNA-seq超强的覆盖度和灵敏性，可以检出许多不曾被预测到的由可变剪接或可变3多聚腺苷化位点选择导致的mRNA isoforms，以及新的ncRNA和antisense RNA （反义RNA）。它在研究真核生物的基因表达调控，癌症等疾病的发生机制和新治疗方案确定，遗传育种等方面具有不可估量的潜力，是后基因组时代