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日粮能量水平对山羊瘤胃上皮细胞周期影响 　　摘要：选取18只青年波杂山羊随机分成高能量组与低能量组，在细胞和分子水平阐述瘤胃上皮增殖及其机理。结果显示：高能量日粮提高山羊瘤胃上皮Cyclin D1蛋白表达，加速细胞周期G1期进程，促进细胞增殖，加快瘤胃乳头生长，揭示了高能量日粮促进瘤胃乳头生长的细胞生物学机制。 　　关键词：高能量日粮；山羊；瘤胃上皮；细胞周期；Cyclin D1 　　中图分类号： S827.5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0145-04 　　收稿日期：2013-09-18 　　资助项目：国家自然科学基金（编号；国家“973”计划（编号：2011CB100801） 　　作者简介：卢劲晔（1983―），男，江苏扬州人，博士，讲师，主要从事动物营养生理研究。Tel：（0523E-mail：leopardleo@163.com。 　　通信作者：沈赞明，从事动物营养生理研究。E-mail：zmshen@。瘤胃是反刍动物消化代谢、营养吸收最重要的场所之一，瘤胃上皮吸收动物消化产生的能量、营养物质，瘤胃上皮的生长发育情况直接影响反刍动物的生产性能。提高动物日粮能量水平可以促进山羊瘤胃上皮生长及山羊个体生长[1]。哺乳动物体细胞数量增多是通过加快细胞的有丝分裂来完成的，细胞从一次有丝分裂结束开始到下一次有丝分裂完成所经历的整个有序过程称为细胞周期。细胞周期运行主要受细胞周期蛋白（cyclin）及细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的调控，细胞周期蛋白表达水平直接影响细胞有丝分裂的速率[2]。本研究探讨高能量日粮对山羊瘤胃上皮细胞周期以及CDK的影响，旨在为提高山羊生产性能提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　选用18只青年波杂山羊（波尔山羊×淮南羊杂交山羊，平均日龄为90 d）作为试验对象。试验开始前，对山羊进行驱虫，山羊自由饮水，采食花生秆，逐渐添加精料至400 g/d，适应期30 d。试验正式开始后，根据体重相近原则，将山羊随机分为高能量组（ME：1.00 MJ/（kg0.75?d），约为维持水平的2.0倍）及低能量组（ME：0.60 MJ/（kg0.75?d），约为维持水平的1.2倍），高能量组及低能量组各9只山羊。所有山羊均单圈饲养，自由饮水，采食花生秆，日粮营养组成见表1。高能量组山羊每天08：00、11：00、14：00、17：00分别饲喂1次100 g精料（精料组成见表1），持续饲喂42 d，第43天屠宰取样。 　　1.2主要试剂 　　碘化丙啶（Sigma公司），RNA酶抑制剂、随机引物、dNTP（Promega公司），RevertAid M-MuLV反转录试剂盒、Taq DNA 　　山羊日粮的组成成分 　　日粮干物质 　　（%）干基营养成分含量（%）粗蛋白质粗脂肪粗纤维粗灰分干物质代谢能 　　（MJ/kg）饲料87.7523.804.157.608.8110.85花生秆89.818.152.2531.467.136.96注：精料由玉米、豆粕、棉籽、麸皮、鱼粉、磷酸钙、微量元素、维生素组成。 　　聚合酶试剂盒（Fermentas公司），引物设计与合成（Invitrogen公司），iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad公司），蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量分析试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司），ECL化学发光检测试剂盒（Pierce公司），PVDF膜（Millipore公司），兔抗Cyclin D1多克隆抗体、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Bioworld公司），鼠抗CDK4单克隆抗体（Abcam公司）。 　　1.3流式细胞术测定山羊瘤胃上皮细胞周期 　　1.3.1瘤胃上皮细胞的分离与固定取约300 mg组织块，用D-Hanks溶液（pH值为7.4，4倍双抗，37 ℃水浴预温）漂洗2～3次后，加0.25%胰酶15 mL，37 ℃水浴，30 min后弃去消化液，取出瘤胃上皮组织，重复3次上述步骤。在处理后的上皮组织中加D-Hanks溶液（pH值为7.4）清洗2次，继续加入胰酶15 mL消化10 min，1 500 r/min离心10 min，收集细胞。用PBS缓冲液（pH值为7.4）洗涤细胞沉淀2次，2 mL预冷75%乙醇重悬细胞，混匀后4 ℃保存待测。 　　1.3.2碘化丙啶（PI）染色与流式细胞仪检测将用75%乙醇固定的细胞用PBS缓冲液（pH值为7.4）洗涤2次以除去乙醇，再用50 μL PBS缓冲液（pH值为7.4）重悬，加入 500 μL PI染液，振荡混匀，室温避光染色15 min，用流式细胞仪检测，每个样品计数10 000个细胞，用CellQuest软件测定