SN_T 2206.10-2014化妆品微生物检验方法 第10部分：金黄色葡萄球菌 PCR法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2206.10—2014化妆品微生物检验方法PCR 法第10部分：金黄色葡萄球菌Determination of microorganism in cosmetics--Part 10 : PCR method for Staphylococcus aureus in cosmetics2014-11-01实施2014-04-09发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局0禁 SN/T 2206.10—2014前創言SN/T2206《化妆品微生物检验方法》共分为13部分：第1部分：沙门氏菌；一第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；-第3部分：肺炎克雷伯氏菌；-第 4部分链球菌;一第5部分：肠球菌；-第6部分：破伤风梭菌;-第7部分:蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原;第8部分：白色念珠菌；一-第9部分：胆汁酸耐受革兰氏阴性菌;-第10部分:金黄色葡萄球菌　PCR法;一-第11部分：金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法；--第 12 部分:绿脓杆菌 PCR 法;一第13部分：嗜麦芽窄食单胞菌。本部分为SN/T2206的第10部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本部分主要起草人：房保海、王波、姜英辉、刘会梅、李正义、杨捷琳、吕蓉、贾俊涛、雷质文、孙涛。 SN/T 2206.10-2014化妆品微生物检验方法第10部分：金黄色葡萄球菌PCR 法1范围SN/T2206的本部分规定了化妆品中的金黄色葡萄球菌PCR检测方法。本部分适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB7918.1化妆品微生物标准检验方法总则GB7918.5化妆品微生物标准检验方法‧金黄色葡萄球菌SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本文件。3.1术语和定义3.1.1金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus为革兰氏阳性细菌,球形，呈葡萄状排列,无芽胞，无荚膜,能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR:聚合酶链式反应,简称 PCR(polymerase chain reaction)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate）Taq:水生栖热菌(Thermos aquaticu)4方法提要化妆品经增菌后，提取增菌液或可以菌落的DNA，以提取的DNA为模板进行金黄色葡萄球菌高保守片段的PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带，从而对化妆品中是否污染金黄色葡萄球菌进行快速检验筛选。1 SN/T 2206.10--20145试剂和耗材5.1SCDLP液体培养基（见 A.1）。5.2PCR 扩增引物：上游引物:5′-GGATGGCTATCAGTAATGTTTCG-3’，下游引物:5′-TTAACCGTATCACCATCAATCG-3，扩增长度247bp,扩增的特异性DNA序列片段和引物对应的位置见附录 B。5.3G+细菌基因组 DNA 纯化试剂盒或其他有效试剂。5.4核酸裂解液:2%CTAB,100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3),1.4 mol/L 氯化钠,20 mol/L EDTA(pH 8.0)。5.5异丙醇。5.670%乙醇：70%无水乙醇，30%灭菌双蒸水（体积）5.7灭菌双蒸水，应符合 GB/T6682-2008中级水的规格5.810XPCR缓冲液（见 A.2）。5.9dNTP:10 mmol/L,每种 2.5 mmol/L5.10琼脂糖(电泳纯)。5.11DNA分子量标志物（50bp～500.bp）5.12GelRed 或 GelGreen 核酸染色剂。5.136×上样缓冲液:30 mmol/L.EDTA.36%体积油、0.05%（质量浓度）二甲苯腈蓝FF、以，0.05%（质量浓度）溴酚蓝。5.14550XTAE缓冲液（见A.3）。5.15Eppendorf 管和 PCR 反应管6仪器设备6.1恒温培养箱：36℃士16.2PCR 仪。6.3电泳仪。6.4凝胶分析成像系统。6.5冷冻离心机：离心力12000g。6.6可调移液器：2.5μL、