血红蛋白与的凝胶过滤.ppt

凝胶层析技术及原理 凝胶:是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体的网状结构. 交联葡聚糖(sephadex) 琼脂糖凝胶(sepharose) 聚丙烯酰胺凝胶(BIO-Gel P) 硅胶 (Silicon dioxide or Silica gel) 凝胶层析(Gel chromatography):? 凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav （被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。 Kav 值的大小与凝胶床的总体积（ Vt ）、外水体积（ Vo ）及分离物本身的洗脱体积（ Ve ）有关，即： Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 在限定的层析条件下， Vt 和 Vo 都是恒定值，而 Ve 值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大， Kav 值小；反之，则 Kav 值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开 凝胶层析应用 1.生物大分子的纯化 凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。 2.分子量测定 在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。 Kav＝－b lg MW＋c Ve＝－b’ lg MW＋c’ 由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。 3.脱盐及去除小分子杂质 利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。 4.溶液的浓缩 利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。 5.蛋白质的复性 为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降低了蛋白之间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。 为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。 影响分离效果的因素 1.基质的颗粒大小、均匀度 2.筛孔直径和床体积的大小 3.洗脱液的流速 4.样品的种类等， 5.缓冲液的pH 6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。 操作步骤1 1.装柱: 检查上下柱帽是否通畅,将接线短的柱帽接在层析柱的下端. 加入1/8柱体积的去离子水或磷酸盐缓冲液,搅拌小烧杯里的凝胶,并连续的装入层析柱中,使沉积后的凝胶高度不低于12cm,接上上端的柱帽,将其连线插入三角瓶里磷酸盐缓冲液中,平衡20分钟. 操作步骤2 2.上样前的准备 调节恒流泵的流速为6—10滴/分钟,并将其进水口与层析柱的下端接线相接. 撤去柱上端的柱帽,放入与柱内径大小一致的滤纸片一块,检查胶面是否平整,层析柱是否均匀.然后将胶面上的缓冲液用排气键放至与胶面相齐,关上恒流泵.切忌干胶! 步骤3 A.上样FeSO4 0.5ml于滤纸面上。开启恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。 B.上1ml磷酸缓冲液