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基因工程知识点总结

??一、基因工程概述

（一）定义

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。

（二）基因工程诞生的理论基础

1.DNA是遗传物质的证明

肺炎双球菌转化实验：格里菲思的体内转化实验证明S型细菌中存在某种转化因子，能将R型活细菌转化为S型活细菌；艾弗里的体外转化实验证明DNA才是使R型细菌产生稳定遗传变化的物质，即DNA是遗传物质，而蛋白质等不是遗传物质。

噬菌体侵染细菌实验：赫尔希和蔡斯分别用35S和32P标记噬菌体的蛋白质和DNA，通过噬菌体侵染细菌的实验，证明了DNA是遗传物质。

2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立

DNA双螺旋结构模型的构建：沃森和克里克提出了DNA双螺旋结构模型，其特点包括两条链反向平行盘旋成双螺旋结构；脱氧核糖和磷酸交替连接，排列在外侧，构成基本骨架；碱基通过氢键连接成碱基对，排列在内侧，且遵循碱基互补配对原则（AT，GC）。

中心法则：遗传信息可以从DNA流向DNA，即DNA的自我复制；也可以从DNA流向RNA，进而流向蛋白质，即遗传信息的转录和翻译。后来发现遗传信息还可以从RNA流向RNA（RNA复制）以及从RNA流向DNA（逆转录）。

3.遗传密码的破译

尼伦伯格和马太采用蛋白质体外合成技术，以多聚尿嘧啶核苷酸（polyU）为模板，在无细胞系统中合成了多聚苯丙氨酸，从而破译了第一个遗传密码UUU代表苯丙氨酸。随后，科学家们陆续破译了其他遗传密码。

（三）基因工程的技术支持

1.基因转移载体的发现

质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒上通常含有多个限制酶切割位点、标记基因等，可作为基因工程的载体。

噬菌体：某些噬菌体经过改造后也可作为基因工程的载体，如λ噬菌体，它能将自身的DNA注入细菌细胞内进行繁殖，可通过改造其基因组，使其携带外源基因并将其导入受体细胞。

2.工具酶的发现

限制性核酸内切酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。例如EcoRⅠ识别的序列是GAATTC，在G和A之间切割。

DNA连接酶：将双链DNA片段缝合起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。根据来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，前者只能连接黏性末端，后者既能连接黏性末端，也能连接平末端。

DNA聚合酶：如TaqDNA聚合酶，用于PCR技术中合成DNA子链，以dNTP为原料，在引物的引导下，按照碱基互补配对原则合成与模板链互补的DNA链。

3.DNA合成和测序技术的发明

DNA合成技术：可通过化学合成法人工合成DNA片段。随着技术发展，能够合成较长的DNA序列，为基因工程中目的基因的获取提供了重要手段。

DNA测序技术：桑格发明的双脱氧链终止法是常用的DNA测序方法之一。其原理是利用DNA聚合酶，以dNTP为原料，加入少量的双脱氧核苷酸（ddNTP），ddNTP缺乏3OH，不能与下一个核苷酸形成磷酸二酯键，从而使DNA合成反应终止。通过电泳分离不同长度的DNA片段，根据片段末端的碱基即可读取DNA序列。

4.PCR技术的发明

PCR技术即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术。它以拟扩增的DNA分子为模板，以dNTP为原料，在TaqDNA聚合酶作用下，利用引物引导合成与模板互补的DNA链。通过高温变性（使DNA双链解开）、低温退火（引物与模板结合）、中温延伸（合成子链）三个步骤的循环，可在短时间内大量扩增目的DNA片段。

二、基因工程的基本操作程序

（一）目的基因的获取

1.从基因文库中获取

基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

基因组文库：包含一种生物的全部基因。构建基因组文库时，首先提取生物的基因组DNA，用限制酶切割成许多片段，然后与载体连接导入受体菌，形成基因组文库。

cDNA文库：只包含一种生物的部分基因。以mRNA为模板，在逆转录酶作用下合成cDNA，再与载体连接导入受体菌，构建成cDNA文库。cDNA文库中的基因没有内含子等非编码序列。

2.利用PCR技术扩增

PCR原理：依据DNA双链复制的原理，在体外通过酶促反应有选择地大量扩增特定的DNA片段。

反应体系：需要模板DNA、引物、dNTP、TaqD