第一章基因与基因组解析.ppt

第一章 基因与基因组及相关技术 1. 基因组大小与C值佯谬 基因组大小在不同生物之间差异很大；如HBV 仅3200 bp，而某些显花植物和两栖类动物可达1011bp。 基因组大小用C值（C value）表示； C值大小基本上反映生物进化程度的差异； 但这种相关性并不很精确； 这种生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值佯谬（ C value paradox ）； C值矛盾主要是由于各种生物基因组的结构特征的差异造成的，低等和高等生物差别明显。 2. 基因总数与N值佯谬 基因总数（ N表示）人类不足3万个，仅比大肠杆菌大7倍，比低等动物秀丽线虫大1.6倍，而水稻高达5万。 果蝇在进化上比秀丽线虫高等，基因总数只有后者的0.6倍。 基因组中基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性，称为N值佯谬（N value paradox）。 问题与可能的解释 问题: 既然一切生物性状都是由基因决定的，那么生物体的DNA含量（C值）和质量（N值）就应该与生物进化阶梯及复杂性成正相关。 可能的解释 生物体结构与功能的复杂程度不仅取决于一定的基因数量，更重要的是在于基因功能及其相互作用网络的复杂性和精确性。 1) 性连锁分析——最常用的家系分析法 如果其性状只出现于男性,则基因位于Y染色体; 如果其性状是隔代交叉遗传，亦即外祖父的某些性状不出现于其母亲，却出现在其外孙子身上； 由于男性的X染色体总是传给女儿，一般不直接从父到子遗传，所以这个基因应位于X染色体上。 如果二个性状都表现出隔代遗传，则这二基因都位于X染色体上； 外祖父法——确定二个X染色体连锁基因的遗传学距离。如X染色体连锁的色盲基因和蚕豆病基因。 2）染色体标记连锁分析法 当已知染色体上的某种标记与某个基因间的连锁关系后，亦可通过家系分析法将基因定于染色体上，并计算出重组率确定遗传学距离。 如Donahue发现自己家系的1号染色体长臂近着丝粒区变长，是一个可遗传标记；随后又发现这一标记与 Duffy血型具有平行性（连锁关系），从而将Duffy血型基因定位。 3）多态性DNA标记 串连重复序列（VNTR）——第二代遗传标记 其核心顺序重复的次数具多态性，现已定位了300余个均匀分布于各个染色体上的VNTR； 由于VNTR的核心顺序两侧的序列是没有个体差异且长度各不相同，因此，以此两侧序列为PCR引物，能获得个体特异的指纹图谱（亦称全基因扫描）。 进行家系全基因扫描时，如发现某些性状总是与某VNTR相连锁，就可以将该基因定位于某一染色体，精度10cM左右。 VNTR多态性亦符合孟德尔遗传，故指纹分析还可应用于遗传病诊断、法医个体鉴定、亲子鉴定等 2) 原位杂交法(in situ hybridization) 原理：以标记的目的基因特异DNA序列或RNA为探针，直接与细胞中期染色体进行分子杂交，显影后即可确定探针杂交的染色体位置（定位）。 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization , FISH ) ：探针以荧光标记（生物素、地高辛等）的原位杂交 FISH能直接完成基因的染色体定位。 3) 原位PCR (in situ PCR) 原理：在单细胞或组织切片上，对目的基因用PCR进行原位扩增，（或再进行分子杂交），从而获得基因的染色体定位信息。 间接法：先对基因进行原位扩增，再进行DNA原位杂交，间接示踪； 直接法：将标记的核苷酸直接掺入PCR产物中，直接示踪。 基本步骤：①固定细胞，蛋白酶部分消化；②原位PCR扩增；③直接法直接显影（如放射身显影、荧光、化学显影等），间接法通过标记探针进行杂交显影。 当然需要与染色分带技术相结合! 4) 定位克隆技术 原理：对通过疾病表型观察到的致病基因，进行基因定位和进一步分离、克隆该基因的策略。 基本策略：①通过家系分析等确定致病基因与多态性标记间的连锁关系或染色体定位；②通过染色体步移进行更精确定位，或以标志性序列探针，从克隆重迭群（contigs）筛选出特异的（contig） ；③再通过DNA测序等确定目的基因的序列，获得基因克隆。 大规模基因组（HGP）测序 大规模基因组计划（HGP），常使用一个或多个测序策略。 首先把基因组变成较小片段并克隆到合适的载体上，获得覆盖全基因组的部分重叠的克隆集合（contigs）。 酵母人工染色体（YAC ）可容纳百万个bp， HGP的大部分工作草图绘制工作是通过该载体完成的。 细菌人工染色体（ BAC）的容量平均为15万bp，克服了YAC那样不易分离操作、容易被剪切和不稳定等缺点， HGP的大部分测序工作是利用该载体实现的。 在得到大片段的克隆重叠群后，再采用不同的测序策略（鸟枪法和步移等）分别测