大电导钙激活钾通道β1亚基和子痫前期的相关性研究.doc

描述：目的：探讨胎盘组织和子宫平滑肌组织中大电导钙激活钾通道β1亚基（KCNM β1）的表达，及其与子痫前期发病的关系。方法：轻、重度子痫前期组（研究组）和正常孕妇组（对照组）孕妇的胎盘组织及子宫平滑肌组织... 　　【摘要】?目的：探讨胎盘组织和子宫平滑肌组织中大电导钙激活钾通道β1亚基（KCNM β1）的表达，及其与子痫前期发病的关系。方法：轻、重度子痫前期组（研究组）和正常孕妇组（对照组）孕妇的胎盘组织及子宫平滑肌组织中KCNM βl mRNA的表达通过荧光定量PCR技术检测。采用ELISA法检测三组孕妇血清KCNM βl浓度变化水平。结果：各研究组中孕妇血清的KCNM βl水平、胎盘组织及子宫平滑肌中KCNM βl mRNA表达水平均明显低于对照组，差异均有统计学意义（P0.05）；而轻、重度子痫前期组比较差异均无统计学意义（P0.05）。结 论：孕妇血清中KCNM βl表达降低，胎盘组织和子宫平滑肌???KCNM βl mRNA的表达降低与子痫前期的发病密切相关，可能参与了子痫前期的病理生理过程。　　子痫前期是妊娠期高血压疾病最常见的类型，其发病率为5%～10%，其导致孕产妇的死亡总数仅次于产后出血和羊水栓塞。目前妊娠期高血压疾病 至今病因不明，有研究将高血压病视为一种细胞膜疾病，高血压的产生是由于大电导钙激活钾通道（high-conductance calcium activated potassium channels，BKca）的缺陷，不能反馈相应代偿作用，而导致动脉平滑肌膜电位极化障碍，使血管紧张性增高，促进高血压的产生。大电导钙激活 钾通道β1亚基（KCNM β1）与子痫前期的相关性目前国内外均无研究，本研究通过孕妇血清中KCNM βl的表达及胎盘组织和子宫平滑肌中KCNM βl mRNA的表达，探讨KCNM βl与子痫前期发病的关系。　　1 资料与方法　　1.1 一般资料 选择2012年2月-2013年2月在本院剖宫产分娩的轻、重度子痫前期孕妇为研究组，轻、重度组各19例；选取同期正常妊娠孕妇20例为对照组。子痫前 期的诊断标准参照丰有吉主编的第7版8年制《妇产科学》。研究组患者均符合以下条件：（1）产妇年龄在26～34岁之间；（2）无高血压病史及家族 史。对照组患者均符合以下条件：（1）产妇年龄在24～34岁之间；（2）无高血压疾病家族史；（3）妊娠期间血压监测记录一直保持在正常范围，即 BP140/90 mm Hg。本次妊娠均为单胎，研究组的孕妇既往无高血压病及慢性肾炎病史。两组孕妇的年龄、分娩孕周比较差异无统计学意义（P0.05），具有可比 性。所有孕妇在研究前均签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准实施。　　1.2 试剂和实验方法　　1.2.1 主要试剂及仪器 Total RNA提取试剂（Trizol）和荧光定量PCR试剂盒均购自日本Takara公司，DNA Maker购自北京百泰克生物有限公司，GelRed荧光核酸染色试剂（Unired）购自美国 Biotium公司。KCNM βl引物由上海生工生物工程有限公司合成，酶联免疫吸附试验（ELISA试剂盒）购自青岛浩赛科技有限公司，所有标本同批测定，批内变异6%。上 海瑞仪公司PCR扩增仪。德国Eppendorf公司常温微量离心机。? 　　1.2.2 标本采集 术前抽取所有孕妇空腹静脉血并分离血清保存，以检测血清中KCNMβl的浓度。剖宫产术中取胎盘组织约2 cm×2 cm×2 cm大小，再取一块子宫平滑肌各约1 cm×1 cm×1 cm大小，分别置于EP管中，冷冻保存以提取RNA。 　　1.2.3 实验方法 （1）血清KCNM βl测定：采用ELISIA法，于回归方程上计算所测样本的OD值所对应的样品浓度。所有标本同批测定，批内变异6%。（2）子宫平滑肌组织和胎 盘组织中的KCNMβl mRNA的提取及测定：所取到的组织通过荧光定量PCR法测定总RNA，严格按照试剂盒操作进行检测。取波长260 nm及280 nm的紫外分光光度计检测总RNA样品的纯度及浓度，并稀释后经l.2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外线下得到完整的5S、18S及28S三条RNA条带。 （3）荧光定量PCR：PCR引物参考国内外的相关文献，设计KCNM βl的PCR引物序列，并与Gene Bank中的基因谱一一核对无误。PCR引物序列及长度见表1。引物稀释至浓度为20 ?mol/L，在Microtube管中配制反转录反应液（详见表2），并在PCR仪上进行反转录反应。按表1.4配制PCR反应液，进行荧光定量PCR 反应。荧光定量PCR反应体系：SYBR Primix Ex TaqTMⅡ 10 μL、上下游引物各0.8 μL，超纯水6.4 μL，cDNA产物2.0 μL；PCR