犬细小病毒时间分辨荧光免疫层析检测卡的制备.pdf

犬细小病毒时间分辨荧光免疫层析检测卡的制备

A.1质控血清的制备

A.1.1犬细小病毒阳性血清的制备

6.67

犬细小病毒阳性血清，将犬细小病毒（TCID50=10/mL）56℃灭活72h，离心取上清液，用抗原

检测为阴性的胎牛血清稀释至500倍，于-20℃可保存1年。

A.1.2犬细小病毒阴性血清的制备

犬细小病毒阴性血清，由抗原检测为阴性的胎牛血清制备而成，于-20℃可保存1年。

A.2抗体的制备

A.2.1犬细小病毒单克隆抗体的制备

A.2.1.1重组蛋白的表达

将犬细小病毒VP2蛋白基因、SUMO标签、His标签串联，优化为大肠杆菌偏爱密码子序列，合

成了犬细小病毒VP2蛋白融合表达目的基因序列，连接至pET-28a原核表达载体构建重组质粒

pET-28a-VP2，经转化构建成基因工程菌pET-28a-VP2-BL21。通过异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷诱导

重组工程菌表达蛋白，并进行目的蛋白的提取纯化，用BCA法测定纯化后蛋白的浓度。

A.2.1.2单克隆抗体的制备

将制备得到的CPV重组蛋白为免疫原，分4次免疫BABL/c小鼠。最后一次免疫3天后进行细胞

融合，再通过ELISA检测筛选杂交瘤细胞，将产生CPV特异性抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养，将

杂交瘤细胞注射到BABL/c小鼠腹腔内，收集腹水并纯化，得到CPV特异性单克隆抗体，通过BCA法

测定抗体浓度，抗体的浓度应不低于1mg/mL，抗体纯度＞90%，于-20℃可保存1年。

A.2.2兔免疫球蛋白G（兔IgG）的制备

将正常兔的血清通过ProteinAAgarose亲和层析分离纯化获得兔IgG，通过BCA法测定抗体的浓

度，抗体的浓度应不低于1mg/mL，抗体纯度＞90%，于-20℃可保存1年。

A.2.3羊抗兔二抗的制备

用兔IgG作为抗原，免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗兔二抗，通过BCA法测定

抗体的浓度，抗体的浓度应不低于1mg/mL，抗体纯度＞90%，于-20℃可保存1年。

A.3荧光微球垫的制备

A.3.1荧光微球的选择和准备

荧光微球按以下要求选择和准备：

a)纳米粒度仪检测镧系荧光微球粒径200nm~320nm，单分散系数PDI为＜0.1。

b)材质及表面基团为聚苯乙烯-羧基。

c)最大激发光波长345nm，最大发射光波长为614nm。

d)镧系荧光微球液体避光保存，在2℃~8℃中呈乳白色，荧光颜色为橙色。

A.3.2荧光微球标记抗体的制备

取200μL含量为1%的镧系（铕）荧光微球溶液，加入5倍体积的硼酸盐缓冲液（0.05mol/L，pH

8.5），以12000rpm离心15min，弃上清，重复洗涤2次，将洗涤后的荧光微球重悬于1mL的硼酸盐

缓冲液中。加入10mg/mL1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺溶液15μL和10mg/mLN-羟基琥珀酰亚

胺溶液30μL混匀，室温（15℃~25℃）活化30min，12000rpm离心15min，用1mL硼酸盐缓冲液

重悬后加入100μgCPV抗体，室温（15℃~25℃）避光震荡4h，加入封闭液，4℃避光震荡8h~12

h，12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL硼酸盐缓冲液洗涤微球1次，并重悬已标记的荧光微球，

混匀，2℃~8℃保存备用。

同上述步骤制备荧光微球标记羊抗兔二抗溶液，将荧光微球标记的CPV抗体溶液和荧光微球标记

的羊抗兔二抗溶液以体积比为10:1进行混合，2℃~8℃保存备用。

A.3.3荧光微球垫的制备

将标记抗体的荧光微球溶液，用喷金点膜仪设置喷量为3μL/cm，每张玻璃纤维素膜（10cm×30cm）

以7mm间隔喷涂，将喷好的荧光微球垫放置在干燥架上，置37℃（±2℃）干燥4h~5h，烘干后剪切，

于4℃~30℃密封保存备用。

A.4包被片材的制备

A.4.1包被溶液的制备

A.4.1.1质控线（C线）包被溶液

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