第十二章遗传工程讲课.ppt

　　第五节 基因工程的应用 目前，基因工程研究发展迅速，已取得一系列重大突破。基因工程技术已广泛用于工业、农业、畜牧业、医学、法学等领域，为人类创造了巨大的财富。 四、DNA的体外重组 1.体外通过限制性内切酶 　的修剪和DNA连接酶的 　连接； 2.目标DNA分子+ 载体 　DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子。 五、目的基因的分离与鉴定 ㈠、基于基因文库的基因分离方法（P267）： 1.构建基因库（library） ： 　　基因文库是由单一来源的特定组织或器官的DNA或cDNA片段汇总形成的克隆群体。 　　 ①. 基因组文库(genomic library) ： 　将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成的。理想的核基因库应能包括全部基因组序列。 ②. cDNA文库： 　　以mRNA为模板è经逆转录酶合成cDNAè构建基因库。 基因组文库与 cDNA文库的比较： 基因组文库包含基因组的所有基因。 cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列。 分离特定基因，cDNA库比较方便。 研究调控序列，必须基因组文库。 2. 从基因库中分离特定的基因： ①. DNA探针： 是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核酸序列。 利用DNA探针可以从基因库中筛选特定的克隆； 制备的探针可以是双链也可以是单链，但在杂交反应中使用的是单链； 探针必须带有标记，如同位素、荧光素等 ②.筛选基因库： 将转化或转染后菌落印影在滤膜上； 用碱裂解使双链DNA变性成单链，牢固地结合在膜上； 再用变性过的目的基因的放射性DNA或mRNA作探针进行杂交 放射性自显影，凡X光片上有黑点即为阳性克隆 定位找出培养皿所对应的菌落 ③. 序列测定和分析： 　　从基因库中筛选出的阳性克隆è 分析、鉴定è 得到目的基因。 一般采用Sanger(1977)发明的双脱氧核糖核酸终止法(dideoxynucleotide chain termination)测定核酸序列。 5’TACGCATACGACATTGCAAC3 ’ ddTATGCTGTAACGTTG5’ ddTGCGTATGCTGTAACGTTG5’ ddTGCTGTAACGTTG5’ ddTGTAACGTTG5’ 待测序的DNA模板 引物 DNA聚合酶 dNTP ddTTP Sanger双脱氧链终止法 ddTAACGTTG5’ ddTTG5’ ddTG5’ 电泳方向 ㈡、T-DNA标签分离基因（P286）： T-DNA T-DNA ㈢、基于PCR的基因克隆： 聚合酶链式反应(polymerase chainReaction，PCR)可以体外快速扩增DNA。 美国Mullis(1986)发明，是现代生物学发展史上的一个里程碑。 PCR反应三个步聚(一个循环)： 1. 变性：94~95℃使模板DNA双链变成单链； 2. 复性：50~70℃下，引物分别与互补的DNA单链互补配对； 3. 延伸：在引物的引导和Taq酶作用下，于72 ℃下合成模板DNA的互补链。 PCR技术的关键 人工合成寡核苷酸片段（引物） 耐热的Taq DNA polymerase （来自Thermus aquaticus，94kDa） PCR方法已成为分子生物学研究常规手段 而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域 PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑 发明人获得了1993年诺贝尔化学奖 ㈣、人工合成基因： 　　根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可人工合成基因。 　　 将目的基因与载体连接，构建重组DNA分子； 重组DNA分子必须导入宿主细胞才能扩增或表达。 第三节 外源基因导入宿主 重组DNA分子的构建 用相同的内切酶酶解目的基因与载体； 将载体与目的基因混合； 用DNA ligase连接。 重组DNA分子的构建 一、重组DNA导入原核生物 原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌。 CaCl2处理转化、电激转化 接合 二、外源基因导入植物 ㈠ 植物表达载体（P271）： 能将外源基因导入植物细胞，并能整合到基因组上； 具有复制起始点和启动子。 Ti质粒 (tumor-Inducing, Ti) 　 　一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞中 。 　Ti质粒一部分DNA叫转移DNA(transfer DNA，T-DNA)， 当农杆菌感染植物时，T-DNA便转移到植物的染色体上，诱导冠瘿瘤， 并能合成冠瘿碱，作为农杆菌的碳源和氮源。 Ti质粒特点： 　具有五个主要功能区域： 　 ①.