第十六章_细胞的破碎讲课.ppt

③渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂(此法对革兰氏阳性细菌不适用)。 ④冻结-融化法 将细胞放在低温下冷冻（约-15℃），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 ⑤干燥法 经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。 干燥的方法有空气干燥、真空干燥、冷冻干燥等。干燥法条件变化剧烈易引起蛋白质变性。提取不稳定生化物质时，常加某些试剂进行保护，如半胱氨酸、琉基乙醇和亚硫酸钠等还原剂。 冷冻干燥技术 广泛应用于药品、生物制品、化工及食品工业。对热 敏性物质如抗生素、疫苗、血液制品、酶激素及其他生物组织，冻干技术非常适用。 目标产物的选择性释放(总目标) 破碎的目的是要得到一种或几种目标产物，因此，在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标产物、而使其它物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，对下游的分离纯化操作的顺利实施是非常重要的。 选择破碎方法原则 ①当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结－融化法等。 ②当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法。 ③当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液pH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出。另外机械破碎法和化学法并用可使操作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。 ④还应注意多种破碎方法相结合，与下游过程 相结合，与上游过程相结合。 ⑤用基因工程的方法对菌种进行改造（溶菌酶）。 * * (1)直接计数法 直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最终染色细胞的计数。 (2)间接计数法 间接计数法是在细胞破碎后，测定悬浮液中细胞释放出来的化合物的量(例如可溶性蛋白、酶等)。 3.3.2 细胞破碎的方法 目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。 (一) 机械法 ①高速搅拌珠研磨破碎法（Fine grinding） ②高压匀浆破碎法（Homogenization） ③超声波破碎法（Ultrasonication） 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎中，采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。 ①高速搅拌珠研磨破碎法（Fine grinding） Netzsch LM-20型珠磨机 高速珠磨机工作原理 水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在同心轴上的圆盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。在料液出口处，旋转圆盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。 在珠磨法中，细胞的破碎率也能用一级速率方程式 表示： ln[1/(1-R)]=Kt K－破碎速率常数 t－停留时间 R－破碎率 破碎速率常数K与许多操作参数有关，如搅拌转速、料液的循环流速、细胞悬浮液的浓度、玻璃小珠的装置和珠体的直径以及温度等。 1.进入珠磨机的细胞浓度和负荷，料液的流速，搅拌器的转速和构型，以及温度等。这些参数不仅影响破碎程度，也影响所需能量。 2. 珠体的大小应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择。 3. 珠体在磨室中的装量影响破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌适宜的珠体装量为80％，珠体量的增加使热扩散性能降低而引起温度升高。 4. 增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，所以搅拌转速应适当。 ②高压匀浆破碎法 操作原理: 原理：利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列