融合基因筛查SOP.doc

Written by编制人： 钟维君 Date日期:2011-5-13 Effective Date生效日期: Distribution Scope发放范围：研发部特检实验室 Reviewed by审核者： Approved by批准人： Refer to addendum for document user approval and annual review information 文件使用批准和年度审核信息请参考附录 31项融合基因筛查标准操作流程 SOP on Fusion Genes of Leukemia 检测信息 项目名称 中文 31项融合基因筛查标准操作程序 英文 SOP on Fusion Genes of Leukemia 检测方法 多重PCR反应 原理及应用 本检测项目利用商品化试剂盒，采用多重PCR方法筛查白血病常见的31种融合基因，可以准确、快速而且可靠地确定白血病的分子类型，提供白血病诊断和治疗的依据。 2. 样本要求 标准 类型 EDTA抗凝骨髓/全血2ml 收集容器 EDTA抗凝管（不含其它物质） 运输容器 带塑胶盖试管 运输要求 0-10?C冷藏运输小于2天 稳定性及储藏要求 室温 短暂 冷藏温度（2-8?C） 3 天 -20(C 三个月（提取出RNA） -70(C 一年（提取出RNA cDNA） 时间要求 无 样本拒收及采取措施 拒绝重度溶血、严重凝血样本、肝素抗凝 影响／干扰因素 溶血、凝血、脂血、骨髓间质较多或肝素抗凝标本可能会严重影响实验结果 其它条件 应避免反复冻融标本 试剂 3.1 订购试剂及试剂盒 试剂名称 厂家 货号 试剂型号及规格 储藏及稳定性 准备工作 逆转录试剂盒 TOYOBO 逆转录酶-20℃保存； 其他4℃保存 逆转录酶4℃备用，其他室温平衡15分钟 KOD PCR试剂盒 TOYOBO 酶-20℃保存； 其他4℃保存 酶4℃备用； 其他室温平衡15分钟 Thunerbird probe QPCR mix TOYOBO -20℃保存； 室温平衡30分钟 TAKARA RTAQ PCR试剂盒 TAKARA 酶-20℃保存； 其他4℃保存 酶4℃备用； 其他室温平衡15分钟 Dutp 上海生工 2mM， 4℃保存 室温平衡15分钟 UNG酶 上海闪晶 -20℃保存； 4℃备用 Trizol Reagent invitrigen 200ml/瓶 4℃保存 4℃备用 100 bp DNA ladder TAKARA 4℃保存 4℃备用 GELred核酸染料 万飞生物 RT RT 3.2 自备试剂 红细胞裂解液；PBS（？） 氯仿，异丙醇，75%乙醇，无水乙醇，RNase-free 水 3.3 引物配置 3.3.1 储存浓度引物（100umol/L）的配制 将Takara订购的32条特异性逆转录引物及多重PCR内外侧引物12000rpm/分钟离心1分钟，超净台静默状态下操作，跟据说明书给出的质量nmol数*10ul加入DEPC-H2O，混匀离心，-20℃保存。 3.3.2 工作浓度引物的配制 3.3.2.1 32条特异性逆转录引物 将储存浓度的32条特异性逆转录引物各取5ul，等量混合，混匀，6000rpm/分钟离心15s，分装，-20℃保存。 3.3.2.2 多重PCR初筛引物 按照《31种融合基因分组表》将融合基因引物分成8组，每组共2管，分内外侧。每管按表中的引物序列号加入储存浓度的多重PCR引物各3ul，内参引物各1.5ul，补水到50ul，工作浓度为6umol/L，混匀离心，分装。-20℃保存。 外侧初筛引物配制表 组别 筛查引物编号 内参引物编号 加水量 S1 111，121，131，141，151，161，171，181 011，021 23ul S2 141，151，231，241，251，261，271，281 011，021 23ul S3 311，011，321，331，341，351，361 021 27.5ul S4 411，421，431，441，461，471 011，021 29ul S5 141，151，531，541，551，561，571 011，021 26ul S6 631，641，651 011，021 38ul S7 711，721，731，741，751 011，021 32ul S8 811，841，851，861，871 011，021 32ul 内侧初筛引物配制表 组别 筛查引物编号 内参引物编号 加水量 S1 112，122，132，142，152，162，172，1