Westernblot分析CTPSOD的跨膜转导.doc

样品准备 不同发酵时间的发酵液（900ul），TCA-丙酮沉淀法沉淀蛋白。 1加脱氧胆酸钠至0.02％终浓度，混匀室温放置至少15min 2加100％TCA至10％终浓度，混匀，室温至少放置1h 3 4度14000转离心10分钟，弃上清，倒置干燥 3 加冰预冷的丙酮，混合，低温放置至少20分钟 5 4度最高转速离心10分钟，倒上清，倒置干燥丙酮 30ul一乘上样缓冲液溶解沉淀，沸水煮5分钟 总体时间3小时 所用试剂： 转膜缓冲液：（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇） 甘氨酸（MW75.07） 2.9g Tris（MW121.14） 5.8g SDS 0.37g 甲醇 200ml 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存，此溶液可重复使用3～5次（此溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）（可以配制成2×转移缓冲液进行保存，稀释后使用） TBS缓冲液：（10mM Tris-Hcl pH7.5, 150mmol/L NaCl） 1 mol/L Tris·HCl（pH7.5） 10ml NaCl 8.8g 蒸馏水至 1000ml （可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用） 10×TBS: Tris 12.11g ，NaCl 88g 蒸馏水至 900ml，调节pH至7.5，定容1000ml Tris 4.844g ，NaCl 35.2g 。蒸馏水至 350ml，调节pH至7.5，定容400ml TBST缓冲液：（含0.05％Tween20的TBS缓冲液） 20％Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，最好现用现配。 封闭液： 脱脂奶粉 5g TBST 100ml 最好现用现配。 或者用含5%BSA的TBST 溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。 制备凝胶 样品制备过程中，制备凝胶 5％浓缩胶12％分离胶 配制凝固时间：分离胶30分钟，浓缩胶50分钟 电泳时间：80V二十分钟，100V 100分钟左右。 可以降低电压，60V 80V 滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。 A. 检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。 B. 检查是否有合适大小的滤纸和膜。 C. 将膜泡入甲醇中，约1-10分钟。再转入transfer buffer中。 D. 将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。 转膜 1.准备6张和凝胶大小相近的滤纸和1张PVDF膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。 2.甲醇活性化PVDF膜：一般活化5-10min，用镊子捏住膜的一边轻轻置于有甲醇的培养皿里浸泡。 3.转膜液浸泡：将电泳好的凝胶剥下，去掉浓缩胶，切割成合适大小，注意目的条带的位置。在加有转移液的培养皿中放入切好的凝胶、平头镊子、一支玻璃棒、滤纸、浸过的膜。 4.在转膜液中对齐三层滤纸，用平头镊子赶出滤纸层中的气泡，夹出放在转膜仪上；分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻璃棒轻轻擀去气泡（由中间向两边赶）。将膜盖于凝胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。擀几下就可合起夹子。整个操作要不断的擀去气泡。 5.盖上转膜仪上盖，设置好电压和时间。一般用半干转膜仪10V 45-60min 6转完后将膜用1×丽春红染液染1-2min（平头蘖枝夹住边缘，轻轻浸入染液）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白（超纯水多洗两遍，）。 将膜晾干备用。 封闭：将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的培养皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。用TBS将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)。 孵育一抗：一抗用封闭液（或者用含有5%BSA的TBST）稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；将PVDF膜放入PE手套中，用封口机将膜封闭，将抗体溶液加到膜的蛋白面（转膜时做好标记）赶出残留气泡；室温下孵育2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次（多洗几次，多加TBST），每次10min；再用TBS洗一次， 5min。 孵育二抗：同上方法准备稀释二抗，摇床，室温下孵育1h后，用TBST在室温 下脱色摇床上洗3次，每次10min；再用TBS洗