高糖环境中单核细胞和内皮细胞相互作用对mt-mmp表达影响的实验研究.docx

兰州大学硕士学位论文高糖环境中单核细胞和内皮细胞相互作用对ＭＴｌ．ＭＭＰ表达的影响的实验研究立题依据随着我国经济社会的发展，人们的生活方式正发生着深刻的变革。随之而来的所谓现代生活方式疾病诸如糖尿病、冠心病等疾病的发病率日渐升高，已经成为威胁我国居民健康的主要病种。在糖尿病的防治中，其慢性并发症的防治占据主要地位。动脉粥样硬化是糖尿病患者致死、致残的主要原因，糖尿病患者动脉粥样斑块破裂诱发心血管事件的发生率及死亡率较非糖尿病患者高２，４倍【１’２１。因此，对其病因及发病机制的研究具有重要临床和社会价值。但是其细胞和分子发病机制尚未完全阐明。血管细胞外基质重构贯穿于整个动脉粥样硬化的发生发展过程［３１，而基质金属蛋白酶ＭＭＰｓ作为细胞外基质的主要调节酶，与动脉粥样硬化的整个病理过程密切相关。研究表明，基质金属蛋白酶在∞１在糖尿病时动脉粥样硬化的发生发展中起着重要的作用。ＭＭＰｓ根据其结构和降解底物的不同可分为四类：（１）胶原酶类（２）明胶酶类（３）基质溶解素类（４）膜型基质金属蛋白酶类（ＭＴ－ＭＭＰｓ）。ＭＴ－ＭＭＰｓ作为一种新近发现的基质金属蛋白酶家族的一员，由于其功能较分泌型基质金属蛋白酶有所不同而引起人们的重视。ＭＴ－ＭＭＰｓ是一个与细胞膜相连接的ＭＭＰｓ亚型，它们是细胞表面水解的核心调节因子，而细胞表面水解调节细胞的迁移、转移和新血管生成。作为一类与细胞膜相连接的的蛋白酶，ＭＴ－ＭＭＰｓ具有独特的调节机制，并与ＴＩＭＰｓ及其他相关分子间有着独特的相互作用。现已知的膜型基质金属蛋白酶有六种，ＭＴｌ～６．ＭＭＰ。ＭＴｌ．ＭＭＰ有多重生理作用：（１）ＭＴｌ．ＭＭＰ可降解多种细胞外基质，可降低动脉粥样硬化斑块的稳定性，与心血管事件的发生相关。（２）ＭＴ－ＭＭＰ还可水解细胞表面多种膜蛋白１４］。（３）ＭＴｌ一ＭＭＰ可以活化ｐｒｏ—ＭＭＰ２和ｐｒｏ—ＭＭＰｌ３［”。在激活ｐｒｏ—ＭＭＰ２过程中，必须有ＴＩＭＰ．２的存在，并与其组成复合物，共同激活ｐｒｏＭＭＰ一２ｔ”。而且部分ＭＴ－ＭＭＰ有膜内段，能较快感受到细胞内发生的病理生理变化。ＭＴＩ．ＭＭＰ可以直接降解，也可以激活其他ＭＭＰ降解细胞外基质，故与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。研究表明，在动脉粥样４兰州大学硕士学位论文硬化斑块有高水平的ＭＴｌ．ＭＭＰ表达ｎ高血糖是糖尿病心血管病变的关键因素之一【７～ｌ，糖尿病病人严格的血糖控制可以延缓心血管疾病的发生发展。高糖的作用涉及氧化应激Ｍ“、ＰＫＣ活性【２７】、ＡＧＥｓ（晚期糖基化终末产物）［２０Ｊ等因素和机制。高糖可以调节多种细胞ＭＭＰ的合成和表达１１６１１９】。ＡＫ Ｆｉｓｈｅｒ等【１９ｌ的研究表明，高糖可增强内皮细胞ＭＭＰ一１、ＭＭＰ．２的表达，降低ＭＭＰ．３的表达。Ｕｅｍｕｒａ等１１７】发现高糖可以促进牛主动脉内皮细胞ＭＭＰ的表达。ＨＡＯ Ｆｅｎｇｌｌ６】等研究发现高糖环境中血管平滑肌细胞ＭＭＰ一２的表达增高。但是高糖环境对于两种关键血管细胞内皮细胞和单核．巨噬细胞ＭＴｌ，ＭＭＰ表达的影响，尚未有研究涉及。单核细胞与内皮细胞相互黏附是动脉粥样硬化形成的关键过程之一【Ｉ“。研究表明单核细胞和内皮细胞的直接接触和旁分泌途径可以促进ＭＭＰｓ表达，从而参与动脉粥样硬化的病理过程【５’６１。而体内和体外实验均表明，糖尿病状态和高糖环境下单核细胞和内皮细胞的相互作用显著增强，因为两种细胞多种黏附分子、细胞因子和炎症因子的合成显著增加【７～１。高糖环境中单核细胞和内皮细胞的相互作用是否会对两种细胞ＭＴｌ．ＭＭＰ的表达产生改变，尚未见有国内外研究报道。本实验通过单核细胞、内皮细胞单独培养，及两种细胞混合培养和隔离共同培养的方法，观察高糖环境中单核细胞和内皮细胞间的相互作用对ＭＴｌ．ＭＭＰｍＲＮＡ表达的影响。兰州大学硕士学位论文材料与方法材料一、ＥＶＣ３０４人脐静脉内皮细胞系购自中国典型培养物保藏中心。二、主要试剂１．ｆ氐糖ＤＭＥＭ培养基：购自美国ＧＩＢＣＯ公司。２．胰蛋白酶：购自华美生物医学公司。３小牛血清：购自杭州四季青生物制品公司。４．Ｐｅｒｃｏｌｌ原液；购自北京索莱宝公司。５．ＲＮＡ提取试剂盒：购自上海生物工程公司。６．酚（饱和）：氯仿：异丙醇－－２５：２４：１混合液。８．１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ：购自上海生物工程公司。９．Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８：购自上海生物工程公司。１０．ｃＤＮＡ合成试剂盒：购自大连宝生物公司。１１．琼脂糖（Ａｇａｒｏｓｅ Ｐｒｏｍｅｇａ）：购白大连宝生物公司。１２．Ｔａｑ酶：购自上海生物工程公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。三、引物引物由上海生物工程公司合成。ＭＴｌ．ＭＭＰ的上游引物序列为：５，．ＡＣＣＴＧＣＧ，１１ＡＣＣＣＡＣＡ．ＣＡＣＡＡ，下游引物序列为：５’．ＣＡＡＡＴＣＡＧＣＣＴｒＧＣａｒＧ他～，扩增产