1991年诺贝尔生理医学奖-膜片钳技术.ppt

1991年诺贝尔生理医学奖 膜片钳技术 Neher和Sakmann将直径1~5μm的玻璃微电极在火上抛光，然后与经蛋白酶处理清洁的细胞表面紧密接触。电极尖端与膜之间的接触，使尖端内的小片膜与其余部位在电学上绝缘，形成50MΩ封接，保证了电流经微电极进入测量电路。以后，Neher又作了改进，用负压轻吸微电极造成管口与膜脂质双层之间非常紧密的封接（千兆欧封接）。千兆欧封接有两个重要后果，首先，小管内和细胞外液之间的电阻高达100千兆欧姆，因此在同一钳位电压下，膜单离子通道开放和关闭引起的离子电流、电导以及通道开放的时间机率及通道的动力学特性等皆可被测定。 第二，微电极尖端管口和膜之间封接的机械强度不同，可以产生几种不同的记录方式。不同的记录方式可用来研究通透性的不同方面。微电极尖端管口所围绕的细胞膜就是要观察离子通道变化的“膜片”，如果在这一小片膜上只含有一个或少数几个通道蛋白分子，则可通过离子通道电导的特点，测定出单一通道开放时的离子电流，从而对单通道的功能特性进行分析。他们应用这套技术顺利地记录了蛙肌肉细胞上单一离子通道电流。结果显示，蛙肌肉细胞的细胞膜上一个离子通道可通过的电流约为20×10-12A，换成离子数目大约是每秒通过一亿个离子。此后，他们又对离子通道的运作，细胞分泌过程及通道的调节功能进行了研究。 膜片钳技术的最主要的优点在于阻抗封接形成的结果使漏出电流极少，所以能正确地进行电压固定。然而不足的是，在形成巨阻抗封接时，由于腔内负压的作用使膜片被吸入微电极腔内，形成所谓的“Ω”形膜片，从而造成不可避免的机械性刺激。 由巨阻抗封接带来的第二大优点是背底噪声水平达到极低。因为由热噪声引起漂移的标准误差与阻抗的平方根值成正比，所以巨阻抗封接是可达到最小。此外，虽然所用的膜片钳放大器的探头场效应管运算放大器电压噪声较小，但对其也不能忽视。由于膜片微电极在安装时的阻抗性电流噪声与封接阻抗（Rs ）成反比，故也可因巨阻抗封接而大大减小。 在膜片钳技术出现之前，在电压固定条件下进行的细胞膜电流记录法，只能向细胞内刺入二根电极或者蔗糖和凡士林进行双重缝隙法（dual gap）从细胞外进行记录，但这两种方法仅适用于非常大的细胞。相反地，应用膜片钳法时对一般较小细胞也能在电位固定的条件下记录出电流。这也是膜片钳法的一个很大的优点。此外，膜片钳技术还有可以直接控制细胞内环境的优点，同时也存在相反的一面，即比较小的胞质中可动分子可被渗漏，这又是它的不足之处。 由于膜片钳技术的诞生，实现了对细胞膜少数几个或某一个离子通道的“开”“关”过程和活动规律的观察，并使研究某些因素（如第二信使物质）对细胞膜通道膜内部分结构的作用成为可能。 可任意的改变膜内外物资的组分，观察膜通道功能变化，为从分子水平研究细胞的活动机制提供有效的机能学方法。 与分子生物学方法结合可拓宽研究范围。 测量膜电容及其变化，研究细胞分泌功能与机制。 尽管膜片钳技术发展的历史不长，但由于它能分辨通过细胞膜单个通道的电路，而多数实验都是以在特定细胞上表达的单个离子通道的性质为研究对象，因此，已得到了广泛的应用，并已取得了许多重大的进展。 通过膜片钳技术，人们才认识到膜通透性变化的本质，了解离子通道可有三种状态：开、关和失活。通道的开放是全或无式的，通道一旦打开形成的离子流幅值恒定，而只有开放时间长短的变化，因此通道开放的机率和开放的持续时间依赖于膜电位和时间。而配基门控通道有关闭、开放和脱敏三种状态，配基与受体的结合和解离的过程比较慢，通道开放态和关闭态的转换比较快，另外配基门控通道还受其他配基和磷酸化的调制。 应用膜片钳技术可证明受体的存在并进行受体分型，即通过快速换液装置加相应的激动剂、拮抗剂及变构性调制剂，记录膜单通道的离子电流，并根据受体的动力学及其它特性来证明所要检测的受体。 膜片钳技术扩展了电生理技术的应用范围，如以往因技术缘故难以研究哺乳动物的小细胞或脆性很大的细胞，而今用膜片钳技术则可进行研究。 膜片钳技术与Fura-2荧光测钙技术结合，一方面以荧光强度监测细胞内Ca2+浓度的变化，另一方面以全细胞膜片钳技术同时记录同一细胞膜电容的变化，进而分析研究细胞内Ca2+浓度与细胞分泌事件之间的关系。 膜片钳技术与单细胞逆转录多聚酶链式反应技术结合，一方面可对形态相似的细胞作基因水平的鉴定，另一方面可对形态相似而电活动不同的细胞作出分子水平的解释。 另外，膜片钳技术还可以揭示细胞内的信息传递、细胞生长过程，甚至包括中枢突触的复杂相互作用，相信不远的将来，这种技术在揭示生物活动奥秘中起着不可估量的作用。 * 主讲人：唐国奎 Neher出生于1944年，德国人1965年毕业于Wisconsin University1976年在耶鲁大学医学院取得医学博士学位此后长期从事基