SN_T 3424-2012黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3424---2012黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. lachrymans2012-12-12发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局创除#份 SN/T3424—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。本标准主要起草人：赵文军、陈青、田茜、牟海青、陈红运、鲁洁、李玲、王哲。 SN/T3424-2012黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了黄瓜细菌性角斑病菌的样品制备、检测方法、结果判定及菌株保藏等。本标准适用于可能携带黄瓜细菌性角斑病菌的黄瓜种子、苗木及其产品的检疫鉴定。2基本信息学名：Pseudomonas syringae pv.lachrymans异名:Pseudomonas lachrymans(Smith Bryan)Carsner 1918,Bacillus lachrymans(Smith Bryan)Holland 1920,Bacterium burgeri (Potebnya) Burgvits 1935,Bacterium lachrymans Smith Bryan 1915,Chlorobacter lachrymans （Smith Bryan)PatelKulkarni 1951,Phytomonaslachrymans (SmithBryan)Bergey et al.1923,Pseudomonas lachrymans f.cucumis Gorlenko1961,Pseudomonasburgeri(Potebnya)KorobkoNikiforuk1972分类地位：细菌界（bacteria），变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria），假单胞菌目（Pseudomonadales），假单胞菌科（Pseudomonadaceae），假单胞菌属（Pseudomonas）。传播途径：带菌种子是远距离传播的主要方式，病菌由气孔、伤口、水孔侵人寄主，通过灌水、风雨、气流、昆虫及农事作业在田间传播蔓延。黄瓜细菌性角斑病菌的其他信息参见附录A。3方法原理根据黄瓜细菌性角斑病菌与抗体之间的特异性反应，对黄瓜种子或产品进行ELISA检测；根据该病菌DNA序列的多态性进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备酶标检测仪、生物显微镜、生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统等。4.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCRPremix、牛肉膏蛋白陈、胰蛋白陈、K,HPO4、KH2PO、MgSO4、琼脂，ELISA检测试剂见附录B。5检疫鉴定方法5.1检测步骤对叶片、幼苗等可直接进行5.3ELISA或5.4PCR检测，对种子可进行5.2种植观察或直接进行1 SN/T3424—20125.3ELISA或5.4PCR检测。若结果为阳性，进行5.5，对可疑菌株再进行5.3ELISA及5.4PCR检测确认，若仍为阳性最后进行5.6生物学接种。5.2种植观察取2000粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，18℃～26℃，相对湿度75%以上，待长出3～·4片叶后观察，若种植期间有发病幼苗，且表现出黄瓜角斑病苗期典型症状（参见附录A），则可采集可疑病株进行5.3ELISA或5.4PCR检测。若该批次种植苗未表现症状，则采集无症状植株叶片分组，进行5.3ELISA或5.4PCR检测。5.3ELISA检测将种子、叶片或幼苗等进行ISA检测，每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染黄瓜细菌性角斑病菌的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。具体操作见附录B。5.4PCR检测以菌株、叶片或种子的DNA两模板，采用特异性引物-PSL-F/PSL-R对样品进行PCR检测，用黄瓜细菌性角斑病菌株作阳性对照用非黄瓜细菌性角斑病菌的植物病原细菌作性对照，用无菌水作空白对照，扩增产物进行电泳分析。性阳性对照扩增片段大小为179b单带，阴性及空白对照无条带，样品扩增结果与阳性对照-致，可判定PCR检测结架为阳性。具体操作步骤和试剂配制见附录C。5.5病原菌分离具体操作步骤见附录D。对化的可疑菌落进行5.3