PicoGreen荧光法检测耗材DNA残留标准操作规程.docx

1目的该方法用于进行国产耗材残留DNA检测。2 适用范围该方法适用于国产耗材入厂质控检验。3 职责3.1 核酸生产中心建库技术组：负责编制和更新本文件。3.2 核酸生产中心QC组：负责执行该问文件。4术语和定义无5.实验原理本实验通过PicoGreen荧光染料与DNA双链结合发出荧光的原理，使用Tecan Infinite F200 Pro 多功能酶标仪进行荧光值检测，并通过Quant-iTTM中 HS reagent建立的标准曲线对待检样品中的DNA定量，该法DNA检出限为0.3pg/uL。6操作步骤6.1试剂准备：配制 2×PicoGreen试剂工作液：用PH=8.01×TE按 1：200的比例稀释浓缩PicaGreen；标准品工作液配置：用1×TE缓冲液将HS reagent标准品梯度稀释配成浓度为0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80 ng/ml的标准品溶液；6.2待检测耗材样品准备:吸头：将待检吸头用洁净的镊子放入15mL试剂管中，按每根110uL 1×TE量将TE加入试剂管中，盖上管盖，上下颠倒混匀10次左右，放在试管加上等待5min；96孔板：用300uL单枪或者排枪使用灭菌带滤芯吸头按每孔110uL量加入1×TE，用吸头吸取TE沿四周内壁冲洗10次左右，放置5min；将上述准备好的标准品工作液和待检测耗材样品各取100uL加入待测酶标板（标准品加入第一列，待测样品从第二列起依次加入），然后取100uL 2×PicoGreen试剂的工作溶液加入酶标板各孔与标准品和待检样品混匀，避光室温放置5min；表1：标准曲线溶液和待测样品溶液制备表2×DNA标准品工作液浓度（ug/mL） 2×PicoGreen体积(uL)2×DNA标准品工作液体积(uL)2×待检样品体积(uL)8010010010040100100100201001001001010010010051001001002.51001001001.251001001000.6251001001006.2酶标仪检测酶标仪参数设定和使用方法参见《Tecan Infinite F200 Pro 酶标仪检测DNA浓度标准操作规程》6.3 标准曲线和测量结果图1：根据标准品测量值Tecan酶标仪软件绘制的2条标准曲线其中：X轴代表样品浓度，单位是ng/mL，Y轴代表原始荧光值，根据标准曲线，软件会制动给出待测样品浓度，最终待测样品DNA总量为样品浓度×100；如果待测样品总浓度30pg，则出示报告时给出具体的值，如果待测样品浓度30pg，出示报告中给出待测样品浓度30pg。8相关文件无9相关记录无10参考文献无11附录附录1：缩写词表附录2：主要设备一览表附录3：主要试剂和耗材一览表附录4：试剂配制方法附录A ：修订记录表附录1缩写词表缩写词全称对应中文翻译SOPStandard Operation Procedure标准化操作流程mgMilligramme毫克μgMicrogramme微克ngNanogramme纳克pgPicogramme皮克nLNanoliter纳升mLMilliliter毫升μLMicroliter微升LLitre升minMinute分钟sSeconds秒TETris and EDTA bufferTE缓冲液注：带“*”标记的缩略词可能是多义缩略词，须注意其全称以及含义，切勿误解。附录2 主要设备一览表仪器名称型号厂家多功能酶标仪Infinite Fe ProTecan(帝肯)附录3主要试剂和耗材一览表表3-1 试剂试剂名称规格厂家TE（PH 8.0）缓冲液500mLAmbionQuant-iT? PicoGreen? P7589InvitrogenQuant-iT? PicoGreen? dsDNA Assay KitQ32854Invitrogen表3-2耗材耗材名称型号厂家1.5ml EP管MCT-150-C AXYGEN 2.0ml EP管MCT-200-C 1000μl 枪头T-1000-B 200μl 枪头T-200-Y 100μl 枪头96孔黑底不透光酶标板Constar3925 CORNING 无粉乳胶手套小号中号上海隆百生物科技有限公司一次性PE手套海门扬子医疗器械有限公司15mL离心管BECTON DICKISON