814中药白芨提取物作为基因载体的制备及表征.doc

中药白芨提取物作为基因载体的制备及表征 【摘要】目的：通过分离提纯来制备作为基因载体的白芨多糖，研究其表征，来分析和探讨白芨提取物即白芨多糖作为基因载体的可行性和可能性。方法:从中药白芨中分离提纯白芨多糖，首先用热水进行抽提，在乙醇中沉淀，脱蛋白等具体方法见[1]，再与高碘酸钾发生还原得到含醛基的多糖，最后在碱性环境中和精胺反应后被硼氢化钠还原得到含有伯胺基阳离子型白芨多糖。进一步的体外实验采用凝胶电泳检测法可以检测出该多糖对质粒中DNA具有结合和保护作用，用所提纯的阳离子型白芨多糖运载基因复合物进行肝癌细胞的感染。结果：白芨的提纯物是一种非还原性不含阳离子基团的多糖物质，阳离子型多糖可以保护质粒基因，体外实验说明该复合物可转染肝癌细胞。结论：分离提纯制备出的阳离子型拜祭多糖承载基因复合物可以与质粒基因结合并保护DNA不被DNA酶降解，该复合物可以转染培养的肝癌细胞。 1 一般资料和方法 1.1 材料资料 选用武汉市医药公司声场的白芨茎块，Sigma公司的高碘酸钾、硼酸、溴酚蓝等产品，增强型绿光荧光蛋白真核表达质粒Pegfp-C1，肝癌细胞由本市的外科实验室提供，其余的试剂均是国产分析纯。85-1型恒温磁力搅拌器、RE-5200型减压旋转蒸发仪、冷冻干燥机等[3-4]。 1.2方法 1.2.1阳离子型白芨多糖的制备和白芨提取物的分离纯化 [11] 从中药白芨中分离提纯白芨多糖，首先用热水进行抽提，在乙醇中沉淀，脱蛋白等具体方法见[1]，首先将白芨块茎制品粉碎，然后过筛，最后烘干、冷凝回流来提取白芨多糖，采用Sevag法将提取物脱蛋白后先在使用阴离子交换纤维素DE-52柱上层析，在Sephadex G-100柱上将层析液再进行层析, 再与高碘酸钾发生还原得到含醛基的多糖，最后在碱性环境中和精胺反应后被硼氢化钠还原得到含有伯胺基阳离子型白芨多糖。将多糖洗脱峰收集, 再经过双蒸水透析后将层析物冷冻干燥则可以得纯化白芨多糖，胺化还原法可以制备阳离子型白芨多糖，对多糖进行纯度鉴定. 1.2.2 运用凝胶阻滞试验法检测阳离子白芨多糖在基因的结合与保护中起到的作用: 将阳离子型白芨多糖和绿色荧光蛋白真核表达质粒pEGFP-C1溶液以混合后液体的多糖中伯胺基与DNA的碱基之比（N/P比)分别为16∶1, 8∶1, 4∶1, 2∶1，1:1的比例混合, , 取8 μL不同N/P比的混合溶液和裸质粒, 用含0.6 μg/L溴化乙啶的12 g/L琼脂糖进行电泳(100 V, 30 min), 并置于254 nm紫外灯下观察和拍照. 在电泳前将130 kU/L DNaseⅠ 1 μL加入含阳离子型白芨多糖的复合物, 在37℃的环境下充分反应，时间为15 min,然后 0℃冰浴30 min来停止反应, 可以检测出其对质粒DNA的保护作用. 1.2.3 对体外培养肝癌细胞HepG2的转染: DMEM高糖培养基含100 mL/L FBS体外常规培养人肝癌细胞HepG2, 每3 d传代1次. 转染前1天用接种针在无菌的环境下以2.5×108/L的标准接种到6孔板中, 待细胞生长到80%汇合度时, 每孔中质粒pEGFP-C1的量为4 μg转染白芨多糖-质粒DNA复合物， 48 h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，脂质体为对照， 2 结果 2.1 白芨提取物作为基因载体的机理 白芨多糖是一种中性的葡萄糖和甘露糖分子比为1/3~1/1.6的葡配甘露聚糖，平均分子量为98~105KDa，由于白芨多糖中不具有阳离子基团的结果，本不具有做基因的载体的特性，采用胺化还原法引入阳离子基团，使其能够结合质粒DNA，能够作为基因载体。 2.2 结合DNA及保护作用 与pDNA结合载体，复合物可以延缓或者阻滞DNA的泳动，没有形成复合物的DNA则可自由的泳动。N/P为1, 2, 4, 8, 16时, 前5个泳道由于DNA酶未降解质粒DNA而使DNA全部滞留在加样孔中, 且荧光亮度随着依次变暗, 第5泳道及其之后的泳道加样孔中基本见不到荧光, 其机理主要是随着N/P比的增加纳米粒完全包裹pDNA于内部, 从而阻碍了溴化乙啶插入其碱基对中.结果表明, 制备的阳离子型白芨多糖具有结合并保护DNA免受DNA酶的降解的功能作用 2.3培养细胞HepG2在体外转染 阳离子型白芨多糖及脂质体两种载体均可转染质pEGFP-C1进入入肝癌细胞HepG2之中,通过体外培养得到的肝癌细胞内均有绿色荧光蛋白表达. 转染载体为阳离子白芨多糖时转染效率约为26.87%±4.27%, 要比脂质体组的转染率38.64%±5.87%低, 两组比较存在差异，差异具有统计学意义，采用 t检验, P0.05。 3 讨论 3.1 白芨的药用价值[9] 自千年前，在民间已经开始