毛细管电泳电化发光检测技术及其在药物.doc

毛细管电泳电化学发光检测技术及其在生命科学中的应用 汪尔康，刘继锋，曹卫东，严吉林，杨秀荣 中国科学院长春应用化学研究所，电分析化学国家重点实验室，长春 130022 周起设 西安瑞迈电子科技有限公司，西安，710054 摘 要 为适应生命科学对高精度分离分析方法的要求，发展高选择性、高灵敏度的检测技术用于毛细管电泳 (CE) 一直是分析科学的研究热点。近年来，我们实验室对于CE 三联吡啶钌 [Ru(bpy)32+] 电化学发光 (ECL)，即CE-ECL 方法进行了系统研究，研制成ECL仪、CE-ECL仪，发展了ECL试剂固定化检测及ECL试剂衍化检测等技术，并应用于临床药物分析。本文对CE-ECL的检测原理、仪器装置、新型检测池、CE-ECL最新发展、在药物和临床分析等方面的应用予以介绍，并对CE-ECL在生命科学中的基因与蛋白质分析、重大疾病标识物的筛选与检测、临床诊断的应用及其微全分析等领域进行展望。 关键词 毛细管电泳 电化学发光 生化分析 引言 基因组学蛋白质学药物基因学生命科学的研究人类疾病相关基因的识别、鉴定和克隆疾病相关基因的结构与功能与疾病防治相关的基因表达的调控实现研制出治疗包括癌症和艾滋病等在内的多种疾病的药物生命科学CE因其分离速度快、效率高、样品用量小等特点而成为近20年分离科学领域发展迅速的分离技术。CE在生物大分子的分离分析中应用较多，尤其是DNA分析[1-3]，用于小分子，例如药物分子的分析也是CE应用的一个重要方面，有关的研究报道和综述很多。例如用于药物-蛋白结合[4]、药物代谢动力学[5]、临床和法医研究等[6]。CE分析中应用较普遍的检测方法有紫外可见光谱，其次是荧光、激光诱导荧光以及质谱方法。荧光、激光诱导荧光以及质谱方法具有较高的检测灵敏度，但是荧光或激光诱导荧光检测往往需要进行化学衍生，质谱检测所需的仪器设备较昂贵。近10多年来，电化学检测，尤其是安培检测因其灵敏、成本低、易集成等特点使其在CE药物分析方面得到了应用[7,8]。我们实验室一直致力于新型电化学检测方法的研究与应用，我们希望检测技术除了灵敏，还需要具有结构简单、操作方便、更好的选择性等特点。我们曾将CE安培检测应用于药物分析[9-12]，近期又将电化学检测器集成到CE芯片上，这些研究将有助于电化学检测应用于CE检测技术。 三联吡啶钌[Ru(bpy)32+] 电化学发光 (ECL)方法目前主要应用于高效液相色谱 (HPLC) 和流动注射 (FIA) 中草酸盐、氨基酸、肽、有机胺、抗生素等物质的分析，此外免疫分析和DNA探针分析是Ru(bpy)32+ ECL技术最有商业价值的应用领域。IGEN公司的蛋白质和核酸Ru(bpy)32+衍生标记试剂及其相关仪器已经在临床疾病诊断 (例如HIV病毒检测)、DNA序列测定、PCR反转录定量分析信使RNA等分子生物学领域中应用。近几年，Ru(bpy)32+ ECL技术逐渐应用于CE，简称CE-ECL[13-21]，检测一些含氮的小分子物质。CE-ECL存在一些技术难点，例如，如何设计毛细管与工作电极的界面，以提高分离效率；毛细管电泳的进样量很小，因此对检测灵敏度提出了很高的要求；如何对ECL非活性的物质进行分离检测等。ECL可应用于生命科学领域，可以预言CE-ECL方法也必将在该领域中显示其快速、高效、灵敏、经济等优点。我们已装置ECL仪、CE-ECL仪，并应用于含氮药物的分析，在动物实验的基础上又进一步将这种技术应用于临床分析，检测了病人体液中的药物含量，实验证明CE-ECL技术对于药物临床分析具有很好的应用价值。我们正进行CE-ECL在药物代谢动力学、药物与蛋白质作用等方面的研究，及用于生物大分子分析。本文力求在介绍前期研究成果和研究思想的基础上，对CE-ECL技术在未来的人类蛋白质组计划以及重大疾病的预警与早期诊断，以及生命科学的其它研究领域展望。 二、研究成果 （一）CE-ECL检测原理 分离出的被测物与工作电极表面电化学氧化产生的Ru(bpy)33+在电极的扩散层区域发生均相ECL反应，产生的光子作为电泳峰记录下来。被测物 (例如有机胺) 也会接触电极表面发生电化学氧化，产生的自由基与Ru(bpy)32+反应，但是该途径对ECL反应的贡献就CE-ECL体系而言可以忽略，因为检测池的毛细管与工作电极界面区域的Ru(bpy)32+与被测物的相对浓度较大。显然，CE-ECL采用的是离柱检测的方式，从毛细管中泳出的部分被测物在未到达电极之前由于扩散或对流作用而进入检测池中，不能接触到Ru(bpy)33+进行ECL反应。这种现象类似于电化学安培检测中遇到的库仑效率的问题。影响发光强度和分离效率的因素主要有发光反应的量子效率和反应速率，较慢的反应动力学导致较差的分离效率，这是CE-